A. Саузерн-блоттинг
В данном методе фрагменты ДНК разделяют с помощью гель-электрофореза под действием капиллярных сил или электрического поля, а затем переносят на мембрану. Фрагменты на мембране гибридизуют со специфическими зондами. Интересующие фрагменты ДНК вырезают из геномной ДНК с помощью ферментов рестрикции или получают с помощью полимеразной цепной реакции (см. В). Детекция ДНК осуществляется с помощью зондов, содержащих радиоактивные или нерадиоактивные метки, и гибридизующихся с комплементарной последовательностью ДНК за счет образования водородных связей Детекция метки производится с помощью ауторадиографии или ферментативной реакции.
Б. Нозерн-блоттинг
Нозерн-блоттинг используется для детекции фрагментов РНК. В данном методе размер и число специфических молекул мРНК определяют в препаратах тотальной или полиаденилированной РНК Молекулы РНК разделяют электрофорезом и переносят на мембрану. Интересующую последовательность РНК детектируют по гибридизации с меченым зондом.
B. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Полимеразная цепная реакция используется для амплификации специфических нуклеотидных последовательностей. Процедура состоит в повторении определенного цикла реакций, каждая стадия которого осуществляется при строго определенной температуре.
Участок двунитевой ДНК (или кДНК после обратной транскрипции РНК) денатурируют с образованием однонитевых фрагментов. В процессе отжига праймеры (олигонуклеотиды, специфические для данной нуклеотидной последовательности) прикрепляются к нити ДНК. На следующей стадии (элонгация) 3'-конец праймера достраивается в соответствии с матрицей под действием термостабильной полимеразы (например, Taq полимеразы). Цикл, состоящий из стадий денатурации, отжига и элонгации, повторяют около 30 раз. Амплификация нуклеотидной последовательности происходит экспоненциально, поскольку каждая нить ДНК, синтезированная полимеразой в данном цикле, служит новой матрицей в последующих циклах. Продукты полимеразной цепной реакции можно разделить электрофоретически и наблюдать в ультрафиолетовом свете после окрашивания бромистым этидием.
Г. Секвенирование ДНК (по Сэнгеру)
Наиболее распространенным методом секвенирования фрагментов ДНК является ферментативный синтез фрагментов, основанный на реакции обрыва цепи. Сейчас существует несколько вариантов автоматических систем, использующих меченные флуоресцентными красителями праймеры или «терминаторы» (дидезок-синуклеотиды), при встраивании которых реакция полимеризации обрывается. В данных системах используют четыре красителя, излучающих свет разной длины волны. Аргоновый лазер возбуждает красители, а детектор регистрирует их специфическое излучение по мере прохождения фрагментов в геле. Данные анализируются с помощью компьютера.
Одним из новых методов является секвенирование однонитевой ДНК с помощью биотинилированных праймеров. В примере, показанном на рисунке, специфическая последовательность встроена в ДНК фага (X-gt II). Биотинилированный праймер (прямой праймер) содержит специфическую последовательность и 5'-последовательность, идентичную универсальному праймеру. Небиотинилированный (обратный) праймер содержит 3'-последовательность и 5'-последовательность, комплементарную универсальному праймеру После амплификации методом ПЦР в присутствии необходимого количества дидезоксинуклеотидов специфические биотинилированные ПЦР-продукты могут связываться с покрытыми стрептавидином магнитными частицами и элюироваться в щелочной среде. Частицы могут быть затем использованы для твердофазного секвенирования.
Аналитические методы
