A. Активация В-клеток
Количественное определение иммуноглобулинов полезно для характеристики функционирования В-клеток in vivo. Однако при недостаточности антител необходимо провести функциональные тесты.
Связывание антител, направленных против поверхностных иммуноглобулинов, приводит к перекрестному сшиванию молекул иммуноглобулинов, что имитирует физиологическую стимуляцию антигеном. Поскольку связывание иммуноглобулинов с Fc-рецептором оказывает ингибирующее действие, то используют Fab-фрагменты из анти-IgM антител. Лиофилизованные клетки бактерии Staphylococcus aureus штамм Cowan С (SAC) являются очень активным индуктором реакции перекрестного сшивания. Как и в Т-клетках, связывание антигена приводит к заметному росту концентрации кальция в цитоплазме в течение нескольких секунд, а также к гиперэкспрессии антигенов CD69 и CD71 (рецептор трансферрина) в течение нескольких часов. За 2-3 дня повышается уровень экспрессии антигенов CD25 и CD23 на клеточной поверхности.
Б. Пролиферация В-клеток
После активации, вызванной перекрестным сшиванием иммуноглобулинов, В-клеткам необходим сигнал пролиферации. Стимулом могут быть цитокины (ИЛ-2, ИЛ-6, фактор роста В-клеток ИЛ-14), растворимые рецепторы (например, растворимые продукты расщепления поверхностного антигена CD23) или связывание антигена CD40 со своим лигандом. Аналогично тому, как это описано в разделе, посвященном Т-клеткам (с 101, Б), в качестве характеристики пролиферации В-лимфоцитов используют количество включенного в клетки за 72 ч меченного тритием тимидина.
При особенно высокой эффективности перекрестного сшивания иммуноглобулинов (например, при использовании бактерий SAC) В-клетки иногда образуют аутокринные факторы роста, что снимает необходимость использования дальнейших экзогенных стимулов.
B. Дифференцировка В-клеток: секреция антител
В культуре клеток В-лимфоциты могут через 5-7 дней превратиться в плазматические клетки. Методы ИФА или РИА можно использовать для количественного определения антител в супернатанте, однако этими методами нельзя определить реальное число В- клеток, производящих антитела. Для нахождения данного параметра используют различные тесты локального гемолиза
1. Обратный метод локального гемолиза. Эритроциты барана конъюгируют с антителами барана или кролика против иммуноглобулинов человека и инкубируют с В-клетками на агарозном геле Терминально дифференцированные В-клетки секретируют иммуноглобулины, которые диффундируют в гель и образуют иммунные комплексы с антителами против иммуноглобулинов человека на поверхности находящихся рядом эритроцитов. Добавляют комплемент и в результате происходит лизис эритроцитов, находящихся поблизости от секретирующих антитела клеток. Число зон лизиса соответствует числу терминально дифференцированных В-клеток.
Этот метод можно использовать для изучения субпопуляций клеток, образующих антитела. Используя эритроциты барана, несущие анти-IgM, можно быть уверенным, что обнаружены будут только те В-клетки, которые секретируют IgM. Если провести реакцию связывания антигенов и эритроцитов барана, то можно определить число В-клеток, образующих антитела против специфических антигенов.
2. Иммуноферментный спот-анализ (EUSPOT). В данном методе В-клетки помещают в чашки, покрытые подходящим антигеном. Специфические антитела, образуемые В-клетками, связываются с антигеном. Свободные антитела и клетки отмывают Потом добавляют связанные с ферментом антитела против иммуноглобулинов, а затем покрывают поверхность чашек гелем, содержащим хромоген. Цветная реакция имеет место там, где произошло связывание специфических антител. В результате образуются цветные пятна, число которых соответствует числу клеток, секретирующих антитела.
Тесты на функционирование В-клеток
