Дезоксирибонуклеиновая и рибонуклеиновая кислоты (ДНК и РНК) присутствуют в клетках всех живых организмов и обеспечивают хранение, передачу и реализацию наследственной информации.
В основе ПЦР лежит естественный процесс репликации (копирования) ДНК, необходимый для деления клеток. ДНК состоит из двух полимерных цепей, удерживаемых водородными связями между азотистыми основаниями и образующих двойную спираль. При этом водородные связи образуются только между определенными (комплементарными) основаниями, поэтому нуклеотидные последовательности обеих цепей однозначно соответствуют друг другу. Ключевым ферментом, осуществляющим репликацию, является ДНК-полимераза, которая синтезирует новую цепочку ДНК, используя имеющуюся в качестве шаблона. ДНК- полимераза не способна сама начать репликацию с любого места одноцепочечной ДНК-матрицы. Для запуска репликации необходимо наличие небольшого фрагмента ДНК (праймера), комплементарного ДНК-матрице. Только в этом случае ДНК- полимераза способна синтезировать новую цепь, последовательно добавляя нуклеотиды начиная от праймера. При этом вновь синтезируемая цепочка ДНК, будучи комплементарной матрице, также становится матрицей в следующем цикле. Проведение нескольких таких циклов позволяет получить большое количество копий определенного фрагмента ДНК, поэтому подобные технологии получили название МАНК. Благодаря амплификации достигается высочайшая чувствительность: исходным материалом для ПЦР может быть даже единственная молекула ДНК. Использование комбинации нескольких специально подобранных праймеров позволяет одновременно определять сразу несколько мишеней в одной пробирке (мультиплексная ПЦР).
Для определения РНК с помощью ПЦР используется другой фермент - обратная транскриптаза (ревертаза, или РНК-зависимая ДНК-полимераза), который обеспечивает синтез ДНК на матрице РНК в процессе, называемом обратной транскрипцией. После обратной транскрипции синтезированная комплементарная ДНК (кДНК) может быть исследована с помощью стандартной ПЦР с получением качественного или количественного результата. Определение РНК необходимо для выявления РНК-содержащих вирусов и оценки активности (экспрессии) генов.
Обследование пациенток с патологическими выделениями
Одной из основных причин обращения пациенток к акушеру-гинекологу являются патологические выделения из половых путей, которые чаще всего ассоциированы с такими заболеваниями, как БВ или вагиниты различной этиологии.
Выявление возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний
Основой диагностики специфического вагинита являются различные методы выявления и идентификации микроорганизмов. Основное требование для диагностических систем в этом случае - максимальная аналитическая чувствительность и специфичность. ПЦР оптимально отвечает этим требованиям. Лечение необходимо проводить при любых формах заболевания вне зависимости от наличия или отсутствия клинических проявлений и количества выявленного возбудителя, поэтому количественных оценок не проводят. Критерием излеченности считают полную элиминацию возбудителя из организма и отсутствие клинических симптомов.
Выявление дисбиотических нарушений
Причиной неспецифического вагинита и БВ является УПМ, представители которой встречаются и у клинически здоровых женщин, поэтому, в отличие от специфического вагинита, само по себе выявление того или иного микроорганизма не является достаточным основанием для постановки диагноза.
Общая обсемененность влагалища и количество отдельных микроорганизмов могут колебаться в достаточно широких пределах как у больных, так и у здоровых женщин. Понимание того, что влагалищная микрофлора - это компонент биоценоза, второй составляющей которого является эпителий влагалища, активно поддерживающий определенный видовой состав обитающих на его поверхности микроорганизмов, позволило по-новому подойти к лабораторной диагностике. В качестве диагностического критерия используются соотношения различных групп микроорганизмов. Изменение соотношения между лактобактериями и УПМ является высокоинформативным диагностическим критерием. Увеличение доли УПМ свидетельствует о дисбиотических нарушениях.
Технически оценить это соотношение крайне сложно. Микроскопический, точнее, бактериоскопический метод не обладает достаточной точностью, так как не позволяет провести видовую идентификацию, ограничиваясь только морфотипами. Бактериологические методы не всегда достаточно эффективны, так как многие микроорганизмы, ассоциированные с влагалищным дисбиозом, плохо культивируются, что не позволяет получить полную картину структуры микрофлоры. Молекулярные методы исследования обладают преимуществом по точности и скорости диагностики. Переход от видовой идентификации к групповой, когда с помощью одной ПЦР-реакции определяется суммарное количество целой группы микроорганизмов, играющих сходную роль во влагалищном биоценозе, позволяет количественно охарактеризовать все видовое разнообразие влагалищного биоценоза без существенных экономических затрат (метод Фемофлор). Практика показала, что с клинической точки зрения полнота охвата всех представителей УПМ гораздо важнее, чем точная идентификация отдельных видов.
Оценка экспрессионного профиля мРНК
С клинической точки зрения дифференциальная диагностика вагинитов и БВ крайне важна, так как в зависимости от диагноза будет меняться тактика ведения пациентки.
Одной из ключевых составляющих врожденного иммунитета является цитокиновая система, которая обеспечивает согласование действий иммунной, эндокринной и нервной систем в развитии реакции воспаления. Цитокины служат для межклеточной сигнализации при развитии воспалительного процесса. Большинство молекул цитокинов не депонируется в клетке, и их секреция всегда связана с синтезом de novo, что, в свою очередь, подразумевает появление в клетке большого количества специфической мРНК, которая может быть идентифицирована с помощью молекулярно-генетических методов. мРНК извлекается из клеток, после чего преобразуется в кДНК, которая может быть амплифицирована и количественно оценена методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Эта методика более точная и технологичная, чем исследование самих цитокинов. Показано, что локальная воспалительная реакция слизистой оболочки влагалища сопровождается выраженным изменением экспрессии генов иммунного ответа. Наблюдается как повышение, так и снижение экспрессии ряда генов при развитии воспаления. На основании этого разработана молекулярно-генетическая диагностическая система для оценки локальной воспалительной реакции во влагалище и цервикальном канале (Иммуно Квантэкс). Поскольку изменения цитокинового профиля предшествуют клиническим проявлениям и развитию лейкоцитарной инфильтрации, диагностическая чувствительность молекулярного метода выше, чем традиционная оценка лейкоцитарной реакции.
Дополнительным преимуществом данного метода является то, что используется та же технологическая платформа, что и для выявления дисбиоза. Все молекулярно-генетические маркеры, используемые в клинической лабораторной диагностике заболеваний нижних отделов женского репродуктивного тракта (транскрипты генов иммунной системы и нуклеиновые кислоты микроорганизмов), могут быть идентифицированы в одном и том же образце с использованием единого метода - ПЦР, что позволяет сократить время диагностики и снизить нагрузку на лабораторию.
Скрининг на онкологические заболевания женской репродуктивной сферы
Молекулярно-генетический скрининг широко используется для профилактики рака шейки матки (РШМ) и наследственной формы рака молочной железы и яичников.
Рак шейки матки
РШМ - практически единственное онкологическое заболевание, полностью удовлетворяющее всем рекомендованным ВОЗ условиям для популяционного скрининга.
Первый метод, который использовался и входил во все скрининговые программы цервикального рака, - цитологическое исследование. Однако ограниченность ресурсов не позволяет обеспечить цитологическим скринингом все население, тогда как для эффективной профилактики РШМ полнота охвата должна быть не менее 80%. Открытие роли вируса папилломы (ВПЧ) человека в развитии РШМ позволило по- новому подойти к проблеме скрининга. Показано, что молекулярно-генетические методы обладают более высокой клинической чувствительностью, тогда как цитологический метод характеризуется высокой клинической специфичностью при выявлении неопластических изменений. Скрининг на основе выявления ВПЧ обеспечивает на 60-70% лучшую 5-летнюю защиту от РШМ по сравнению с цитологическим скринингом. Выявление ДНК ВПЧ является значимым фактором риска развития РШМ, поэтому ВПЧ-положительные женщины обязательно нуждаются в цитологическом обследовании для установления степени неопластической трансформации и выбора соответствующей тактики ведения. Гораздо важнее с практической точки зрения, что ВПЧ-отрицательные пациентки не нуждаются в цитологическом исследовании, поскольку вероятность наличия у них интрацервикальной неоплазии незначительна. Однако действующий Порядок оказания акушерско-гинекологической помощи не позволяет заменить один метод другим. В то же время проведение так называемого одномоментного скрининга, когда всем пациенткам сразу проводится и молекулярно-генетическое, и цитологическое исследование, нецелесообразно, поскольку не обеспечивает лучшую защиту от РШМ, по сравнению только с ВПЧ-исследованием, но существенно перегружает цитологическую лабораторию бессмысленной работой.
Профилактика рака молочной железы и яичников
Рак молочной железы (РМЖ) и рак яичников (РЯ) представляют собой важную социально-медицинскую проблему в связи с высокой заболеваемостью и смертностью среди женского населения. От 5 до 10% случаев РмЖ, от 10 до 17% случаев РЯ являются наследственными.
Наличие мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 связано с высоким риском наследственного РМЖ и РЯ.
Онкологически отягощенный семейный анамнез является бесспорным и самым важным показанием к генетическому тестированию, однако более чем у 20% носительниц мутаций в семье не было отмечено случаев злокачественных новообразований. Поэтому целесообразно проводить популяционный скрининг на мутации генов BRCA.
Определение мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 позволяет выявить пациенток, нуждающихся в пристальном диспансерном наблюдении, для возможно более раннего выявления начальных стадий онкозаболевания. Также BRCA-статус больных РМЖ может быть использован при выборе химиотерапевтического лечения.
В панель для первичного генетического скрининга в группах риска с наследственной предрасположенностью к РМЖ и/или РЯ должны быть включены наиболее распространенные в российской популяции мутации в генах BRCA1 и BRCA2. В 70% случаев при РМЖ и в 60% случаев при РЯ встречается мутация 5382insC, часто встречаются мутации 4153delA, Cys61Gly, 185delAG, 2080delA, также отмечены мутации 3819delGTAAA, 3875delGTCT в гене BRCA1 и мутация 6174delT в гене BRCA2.
Исследование генома
Выявление маркеров наследственных болезней
Наследственные болезни - заболевания, главным этиологическим фактором которых является генная, хромосомная или геномная мутация. Они занимают значительную долю в структуре детской заболеваемости и смертности. Основными профилактическими методами являются медико-генетическое консультирование семьи и скрининг.
Большинство наследственных болезней характеризуется аутосомно-рецессивным наследованием.
Для большинства широко распространенных на территории Российской Федерации аутосомно-рецессивных заболеваний выявлены мутации, являющиеся причиной болезни, что используется при диагностике. При этом можно выделить так называемые мажорные мутации, которые встречаются наиболее часто в данной популяции. Примерами являются делеция delF508 в гене CFTR при муковисцидозе или замена R408W в гене PAH при фенилкетонурии. Наличие «мажорных» мутаций является благоприятной ситуацией, позволяющей сконцентрировать на них диагностический поиск. Использование ДНК-скрининга позволяет не только выявить больных, но и идентифицировать здоровых носителей, у которых потенциально может родиться больной ребенок. ДНК-диагностика «мажорных» мутаций, обладающая высокой чувствительностью, является относительно дешевым и легко осуществимым методом преконцепционного скрининга.
Прекоцепционный скрининг - это массовый скрининг будущих родителей на этапе планирования семьи (до зачатия). В случае выявления носительства «мажорной» мутации у одного из партнеров пара должна быть направлена на медикогенетическое консультирование для решения вопроса об углубленном обследовании второго партнера на носительство редких мутаций, вызывающих соответствующее заболевание. Преконцепционный скрининг относится к методам первичной профилактики наследственных заболеваний, поэтому в ходе подготовки к беременности целесообразно рекомендовать обследование на носительство мутаций, вызывающих наиболее распространенные наследственные болезни (муковисцидоз, фенилкетонурия и др.).
Выявление генетической предрасположенности к многофакторным заболеваниям Мультифакторные болезни (болезни с наследственной предрасположенностью) - заболевания, которые развиваются в результате взаимодействия определенных комбинаций генетических маркеров и специфических воздействий факторов окружающей среды.
Основное значение в акушерско-гинекологической практике имеет генетически обусловленная предрасположенность к нарушениям в системе гемостаза - склонность к тромбофилии или кровотечениям. Основными генетическими маркерами высокого риска тромбофилии являются дефекты генов II и V факторов свертывания крови (мутация гена протромбина и лейденская мутация). Согласно рекомендациям ВОЗ, наличие этих генетических маркеров является абсолютным противопоказанием для назначения оральных контрацептивов и гормональной заместительной терапии.
Также для определения индивидуальной потребности в фола-тах для профилактики врожденных пороков развития плода может быть рекомендовано исследование полиморфизмов генов ферментов фолатного цикла. Дефекты гена MTHFR повышают риск фолатзависимых пороков развития плода и требуют назначения более высоких доз фолатов при планировании беременности.
Список литературы
1. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Донников А.Е. Цитокиновый профиль иммунокомпетентных клеток влагалища при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе // Уральский медицинский журнал. 2011. Т. 3, № 81. С. 44-49.
2. Любченко Л.Н., Батенева Е.И. Медико-генетическое консультирование и ДНК- диагностика при наследственной предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников: Пособие для врачей. М.: ИГ РОНЦ, 2014. 74 с.
3. Новик В.И. Скрининг рака шейки матки // Практическая онкология, 2010. Т. 11, № 2. С. 66-73.
4. Сухих Г.Т., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В. и др. Профиль экспрессии мРНК генов цитокинов в вагинальных мазках женщин репродуктивного возраста при неспецифическом вагините и бактериальном вагинозе // Акушерство и гинекология. 2011, № 7-2. С. 33-38.
5. Borges S., Silva J., Teixeira P. The role of lactobacilli and probiotics in maintaining vaginal health // Archives of gynecology and obstetrics. 2014. Vol. 289, N 3. P. 479-489.
6. Lazenby G.B., Soper D.E., Nolte F.S. Correlation of leukorrhea and Trichomonas vaginalis infection // J Clin Microbiol. 2013. Vol. 51, N 7. P. 2323-2327.
7. Mendling W. Vaginal Microbiota // Adv Exp Med Biol. 2016. Vol. 902. P. 83-93.
8. Ronco G., Dillner J., Elfstrom K.M. еt al. Efficacy of HPV-based screening for prevention of invasive cervical cancer: follow-up of four European randomised controlled trials // Lancet. 2014. Vol. 383, N 9916. P. 524-532.