Применение иммунологических методов исследования периферической крови дает возможность охарактеризовать иммунологический фон, на котором развивается большинство гинекологических заболеваний, и позволяет контролировать эффективность лечения в первую очередь иммуномодулирующими препаратами.
Основными параметрами иммунного статуса при исследовании изменений в иммунной системе пациентки являются количество и активность циркулирующих в периферической крови субпопуляций лимфоидных клеток с различным фенотипом, характеризующих клеточное звено иммунитета, а также концентрация сывороточных иммуноглобулинов и уровень специфических антител, характеризующих гуморальное звено иммунитета. Клеточный и гуморальный иммунитет находятся в тесной взаимосвязи. Частью неспецифического врожденного иммунитета являются особые белки - интерфероны и компоненты комплемента, способные быстро реагировать на патогены и разрушать вредные для человека бактерии и вирусы.
2.3.1. Характеристика клеточного звена иммунитета
Количественное определение субпопуляционного состава лимфоцитов является одним из основных тестов в оценке клеточного звена иммунитета. Фенотипированием называют определение поверхностных антигенов (АГ) лимфоцитов, связанных с их биологическими функциями. В основе метода лежит связывание флюоресцентно меченных моноклональных антител поверхностными АГ лимфоцитов и анализ образцов с помощью проточной лазерной цитометрии. Среди лимфоцитов человека выделяют три основные популяции: Т-лимфоциты (поверхностный фенотип CD3+), В- лимфоциты (CD19+), естественные киллерные клетки, или NK-клетки (CD16,56+). Т- лимфоциты, обеспечивающие клеточный иммунитет, специализируются на уничтожении клеток организма, которые инфицированы размножающимися внутриклеточно возбудителями инфекции, играют важную роль в элиминации опухолевых клеток, в реакциях «трансплантат против хозяина». Т-клетки подразделяются на две основные субпопуляции: Т-хелперы (CD3+CD4+), помогающие в осуществлении иммунного ответа, и цитотоксические Т-клетки (CD3+CD8+), обладающие преимущественно цитотоксической активностью, а также ряд минорных субпопуляций. К минорным относятся Т-регуляторные клетки [CD3+CD4+CD25+(Foxp3)], выполняющие супрессорную функцию. В-лимфоциты отвечают за продукцию антител, обеспечивая специфический гуморальный иммунный ответ. В периферической крови они в основном представляют 2 субпопуляции: В2- лимфоциты (CD19+), специализирующиеся на продукции антител к чужеродным (инфекционным) агентам, и В1-лимфоциты (CD5+CD19+), продуцирующие антитела, специфичные к собственным белкам организма. В1-лимфоциты в норме синтезируют антитела, менее специфичные, чем антитела, синтезируемые В2-лимфоцитами. Популяция NK-клеток (CD3-CD16+56+) в организме выполняет две функции:
1) лизис трансформированных (опухолевых) и инфицированных вирусами клеток;
2) регуляция врожденного и адаптивного иммунных ответов за счет секреции хемокинов и цитокинов.
В табл. 2.3 представлен субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови условно здоровых женщин. Определение процентного состава Т-, В- лимфоцитов и NK-клеток и расчет количественного содержания клеток, а также сопоставление их с нормативными показателями используются при характеристике иммунодефицитных и аутоиммунных состояний, опухолевых и вирусных заболеваний, для подтверждения диагноза и мониторинга состояния иммунной системы пациентки в процессе лечения.
Таблица 2.3. Нормативное содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови взрослых женщин
|
Показатель |
Нормативы |
|
|
Отн., % |
Абс., х 109 клеток/л |
|
|
Лейкоциты |
4,5-9,5 |
|
|
Лимфоциты |
18-39 |
1,6-2,4 |
|
Т-лимфоциты CD3+ |
56-75 |
1,0-1,6 |
|
Т-хелперные клетки CD4+ |
34-48 |
0,6-1,2 |
|
Соотношение CD4 n CD8+-субпопуляций Т-лимфоцитов |
1,5-2,6 |
|
|
Т-лимфоциты с киллерной функцией CD3+CD16+CD56+ |
0-10 |
0,0-0,2 |
|
Натуральные киллерные клетки CD56+ |
8-18 |
0,1-0,4 |
|
В2-лимфоциты CD19+ |
5-16 |
0,1-0,4 |
|
В1-лимфоциты CD5+CD19+ |
0-2 |
0-0,1 |
Данный метод эффективен для характеристики субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови при наличии или подозрении на наличие иммунодефицитных состояний. Определение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови важно в диагностике иммунных нарушений при воспалительных заболеваниях половых путей, эндометриозе, бесплодии и привычном выкидыше. Обнаружение дисбаланса в субпопуляционном составе лимфоцитов периферической крови является предпосылкой для назначения иммуномодулирующей терапии пациенткам с гинекологическими заболеваниями и отягощенным акушерским анамнезом с последующим контролем нормализации ненормативного содержания субпопуляций.
Для определения функционального состояния лимфоцитов исследуют способность этих клеток размножаться в ответ на введение митогенов, продуцировать пептидные молекулы (цитокины) или иммуноглобулины (антитела). Цитотоксическая активность NK-клеток определяется по их способности лизировать клетки-мишени.
Цитокины, обеспечивающие взаимодействие между клетками и играющие важную роль в развитии физиологических и патологических процессов, представляют собой универсальную систему регуляции на уровне организма. Они осуществляют связь между эндокринной, нервной, кроветворной и иммунной системами, вовлекая их в формирование комплексной защитной реакции организма на внедрение чужеродных агентов или трансформацию собственных клеток, участвуя в регуляции воспалительных и аутоиммунных реакций, противоопухолевой и антивирусной защиты. Для цитокинов характерны работа по сетевому принципу и частое наличие каскадности.
Для правильной постановки диагноза и назначения адекватной терапии важное значение имеет выявление дефектов в системе, представленной клетками- продуцентами цитокинов, уровнем цитокинов и рецепторами клеток-мишеней. С помощью метода проточной цитофлуориметрии можно определить экспрессию рецепторов, распознающих патоген или антиген на клетках-продуцентах и рецепторов цитокинов на клетках-мишенях. Количественное определение с помощью ИФА или мультиплексного метода уровней цитокинов в сыворотке или других биологических жидкостях отражает текущее состояние иммунной системы.
Спонтанная продукция цитокинов мононуклеаров в культуре свидетельствует об активации клеток in vivo. Индуцированный стимуляторами in vitro синтез цитокинов отражает потенциальную способность клеток отвечать на антигенный стимул. Сниженная индуцированная продукция цитокинов может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния, обусловленного заболеванием или лекарственными препаратами.
Фагоциты (нейтрофилы, моноциты/макрофаги) являются частью защитной системы организма, выполняя важные функции поглощения и разрушения патогенных микроорганизмов, удаления погибших собственных клеток, представления антигена лимфоцитам, продукции цитокинов и ростовых клеточных факторов. Диагностику нарушений врожденного иммунитета обычно проводят, определяя фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов. Для оценки фагоцитарной системы подсчитывают фагоцитарный индекс, фагоцитарное число (отражает поглотительную способность нейтрофилов) и индекс бактерицидности (отражает переваривающую способность нейтрофила). Функциональное состояние фагоцитов периферической крови (гранулоцитов и моноцитов) оценивают с помощью высокочувствительной люминол-зависимой хемилюминесценции, спонтанной или стимулированной зимозаном. Метод используют для прогнозирования тяжести заболевания и контроля эффективности терапии при воспалительных процессах.
2.3.2. Характеристика гуморального звена иммунитета
Уровень сывороточных иммуноглобулинов
Нормативное содержание основных классов иммуноглобулинов в образцах сыворотки крови для IgM составляет 0,5-2,0 г/л, для IgG - 8,0-16,0 г/л, для IgA - 0,7-3,0 г/л.
Выявление специфических антител к инфекционным агентам
Лабораторные исследования, основанные на определении антител к возбудителям инфекций (а в некоторых случаях АГ инфекционного агента в сыворотке крови), называют серологическими. Для выявления реакции иммунной системы на инфекционный АГ определяют антитела классов IgM и IgG. Определение суммарных антител (IgM+IgG) используется в скрининговых исследованиях таких инфекций, как ВИЧ, гепатит В, гепатит С, сифилис, TORCH-инфекции [токсоплазмоз, краснуха, цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) и герпесвирусная инфекция].
Серологические методы, дающие ответ в формате «обнаружено - не обнаружено», называются качественными. В количественных методах результат выражается в виде числового значения.
Выявление IgG-антител служит показателем ранее перенесенного заболевания. По существенному изменению титра антител при повторном исследовании (с 7-14дневным интервалом) можно судить о стадии заболевания. Обнаружение IgM- антител свидетельствует о недавнем инфицировании или об активном процессе, повышение их уровня происходит при реактивации или реинфицировании. Обнаружение высокого уровня IgA свидетельствует об остром или подостром процессе. Отрицательные результаты чаще всего свидетельствуют об отсутствии инфекции. Полностью отсутствие инфекции исключить нельзя, так как пациент может находиться на серонегативной стадии инкубационного периода инфекционного процесса.
Уровень специфических антител в периферической крови женщин
Некоторые специфические диагностически значимые антитела определяют у женщин с отягощенным акушерским анамнезом при подготовке к беременности и у женщин с бесплодием неясного генеза при подготовке к программам вспомогательных репродуктивных технологий.
Антиовариальные антитела классов IgG, IgM, lgА могут вызывать у женщин бесплодие, преждевременную недостаточность яичников, неудачи в циклах ЭКО и переноса эмбриона. Нормальный уровень: 0-10 Ед/мл.
Аутоиммунные антитела классов IgG, IgM, IgA, направленные к АГ зоны пеллюцида, присутствующие в цервикальной слизи и маточном секрете, также могут быть причиной иммунного бесплодия у женщин с эндометриозом, бесплодием неясного генеза, преждевременной недостаточностью яичников. Нормальный диапазон концентраций антител: 0-10 Ед/мл.
Антифосфолипидные антитела могут ассоциироваться с эндометриозом, бесплодием неясного генеза, неудачами в циклах ЭКО и переноса эмбриона.
К лабораторным критериям антифосфолипидного синдрома относят обнаружение волчаночного антикоагулянта, антител к кардиолипину классов IgM и/или IgG в среднем и высоком титре и/или к β2-гликопротеину-I в титре, превышающем 99-й процентиль от нормы.
Повышенные уровни антител к ХГЧ классов IgM (>30 Ед/мл) и/или IgG (>25 Ед/мл) наблюдаются значимо чаще у женщин с невынашиванием беременности (65%) или бесплодием (53%), особенно с неэффективными попытками ЭКО и переноса эмбриона в прошлом, по сравнению со здоровыми фертильными женщинами (13%).
Антитела к прогестерону классов IgM и IgG с высокой частотой выявляются у женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе (в 42% случаев), с бесплодием (45%), получающих лечение методом ЭКО и переноса эмбриона, значимо чаще, чем у здоровых фертильных женщин (в 11% случаев). У женщин с антителами к прогестерону вне беременности наблюдается более высокая частота дисменореи и гипоплазии эндометрия по сравнению с женщинами без антител к прогестерону.
Антиспермальные антитела (АСАТ) - это иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA, которые связываются с АГ на поверхности сперматозоидов и в зависимости от локализации могут нарушать функциональную активность сперматозоидов, обездвиживая их, препятствуя их проникновению в полость матки через цервикальный канал и нарушая взаимодействие с яйцеклеткой. АСАТ могут присутствовать либо у одного из половых партнеров (в эякуляте, в цервикальной слизи), либо у обоих в сыворотке крови. Наибольшую клиническую ценность имеет выявление АСАТ в цервикальной слизи. Цервикальную слизь для анализа собирают в период овуляции.
До анализа слизь можно хранить в замороженном состоянии при -18 °С в течение 2 нед. Прямым методом выявления АСАТ в цервикальной слизи является метод проточной цитофлуорометрии. Нормативные уровни АСАТ в цервикальной слизи: для IgG <14%, для IgM <6%, для lgА <15%.
Супружеским парам с бесплодием неясного генеза при отсутствии АСАТ в сперме супруга рекомендуется проведение посткоитального теста (ПКТ, или проба Шуварского).
Анализ проводят за 2-3 дня до или после овуляции. Супругам необходим половой покой в течение 3-4 дней. Лучшее время проведения - спустя 2,5-8 ч после полового акта. При проведении теста необходимо исключить использование мыла до и после полового контакта, влагалищных препаратов, лубрикантов, при завершении полового акта женщине необходимо лежать в течение 30 мин с приподнятым тазом.
Оценка качества цервикальной слизи проводится по пяти параметрам: объему, консистенции, растяжимости, способности к кристаллизации, рН и содержанию клеток. Каждый параметр оценивается по шкале от 0 до 3 баллов. Сумма баллов, полученная при оценке всех параметров, составляет цервикальное число, варьирующее от 0 до 15 баллов. Показатели ПКТ зависят от значений цервикального числа, сниженный уровень которого отрицательно влияет на подвижность сперматозоидов.
Важное значение при проведении ПКТ имеет также оценка pH цервикальной слизи (в норме 6,0-8,5).
Подсчет сперматозоидов может осуществляться в эндоцервикальной слизи. При положительном ПКТ число сперматозоидов с прогрессивным движением, определяемое в поле зрения микроскопа (х 400), не должно быть менее 5. При числе сперматозоидов от 1 до 4 тест считается слабоположительным, при отсутствии сперматозоидов - отрицательным. Наличие адекватного числа подвижных сперматозоидов в цервикальном канале позволяет исключить цервикальные факторы как причину бесплодия.
В том случае, если не выявлено отклонений в качестве цервикальной слизи и в уровне рН, сниженные показатели ПКТ свидетельствуют о высокой вероятности иммунного бесплодия, обусловленного присутствием АСАТ в цервикальной слизи. Для более детального исследования взаимодействия цервикальной слизи и спермы, а также в случае отрицательного ПКТ используется тест Курцрока-Миллера. Для оценки качества нескольких образцов спермы необходимо использовать цервикальную слизь высокого качества, которую рекомендуется получать у пациенток при проведении инсеминации спермой в естественном цикле или после стимуляции овуляции гонадотропинами.
Нарушения в иммунной системе являются важным звеном в патогенезе различных форм эндометриоза и злокачественных новообразований, а также бесплодия неясного генеза, ассоциированного с наличием антиспермальных антител, антифосфолипидным синдромом, в патогенезе идиопатического привычного выкидыша и привычного выкидыша, ассоциированного с целым перечнем аутоиммунных антител. Иммунологические методы необходимы для оценки эффективности новых диагностических и лечебных технологий, включающих патогенетически обоснованную индивидуально подобранную иммунотерапию с учетом особенностей иммунной системы конкретного пациента.
Список литературы
1. Амян Т.С., Кречетова Л.В., Перминова С.Г., Вторушина В.В. Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с цитотоксической, киллерной и регуляторной функцией у женщин с повторными неудачами имплантации в программах ВРТ//Акушерство и гинекология. 2017. № 12. С. 78-83.
2. Романовская Т.Р., Зафранская М.М., Нижегородова Д.Б., Савицкая Т.В., Мельникова Я.И. Методы иммунологических исследований: лабораторный М54 практикум. М.: ИВЦ Минфина, 2017. 100 с.
3. Gong P., Shi B., Wang J., Cao P., Diao Z., Wang Y., Hu Y., Li S. Association betweenTh1/Th2 immune imbalance and obesity in women with or without polycystic ovary syndrome // Gynecol Endocrinol. 2018 Aug. Vol. 34, N 8. P. 709-714. doi: 10.1080/09513590.2018.1428301.
4. Rantsi T., Ohman H., Puolakkainen M., Bloigu A., Paavonen J., Surcel H.M., Tiitinen A., Joki-Korpela P. Predicting tubal factor infertility by using markers of humoral and cell- mediated immune response against Chlamydia trachomatis // Am J Reprod Immunol. 2018 Nov. Vol. 80, N 5. P. e13051. doi: 10.1111/aji.13051.