Основные различи» в строении эукариотической и прокариотической клетки существенно влияют на локализацию метаболических процессов в них при незыблемости принципа единства строения, функции и состава, основанного на положениях клеточной теории Т. Шванна (табл. 14).
Для осуществления метаболизма микробная клетка нуждается прежде всего в питательных веществах.
Ими являются соединения, которые поглощаются микроорганизмами из окружающей среды для удовлетворения своих потребностей в исходных материалах для биосинтеза (синтеза макромолекул из более простых соединений) и получения энергии.
По своему назначению питательные вещества можно разделить на две группы. Первую составляют соединения, используемые для синтеза различных компонентов клетки, в основном цитоплазмы. Это пластический, или строительный, материал. Сюда, в первую очередь, относятся аминокислоты. Вторая группа представлена веществами, служащими источником энергии для клетки. При их окислении или расщеплении микробами выделяется энергия, необходимая клетке для роста и размножения. Типичным представителем этой группы веществ является глюкоза. Как известно, основным источником энергии на Земле является Солнце. Однако солнечную энергию способны использовать непосредственно лишь немногие микроорганизмы. Их называют фототрофами. К ним относятся цианобактерии, фотосинтезирующие бактерии.
Большинство микроорганизмов, использующих энергию, заключенную в различных химических соединениях, являются хемотрофами. Они, в свою очередь, подразделяются на две группы: если используются неорганические соединения, то микроорганизмы относятся к хемолитотрофам, если органические - то к хемо- органотрофам.
Количество неорганических веществ, окисляемых хемолитотрофными микробами, невелико. Это сероводород, водород, тиосульфат, нитриты и некоторые другие. Наоборот, источники энергии, используемые хе- моорганотрофами, более многочисленны (табл. 15).
Соединения, входящие в приведенные группы питательных веществ, играют обычно двоякую роль. Так, аминокислоты могут также являться источником энергии при их расщеплении, а глюкоза служит строительным материалом для построения полисахаридов клетки.
Таблица 14
Локализация функций в эукариотической и прокариотической клетке
|
Структура (органелла) |
Прокариотическая клетка |
Эукариотическая клетка |
|
1 |
2 |
3 |
|
Клеточная стенка |
Встраивание готовых компонентов клеточной стенки в пептидогликановый скелет, образование пептидных связей, формирование муреина |
Связь с соседними клетками, транспорт жидкости (растения) |
|
Плазматическая мембрана |
Обмен веществ (транспортные системы), рецепция, межклеточное узнавание. Система переноса электронов и окислительного фосфорилирования (АТР-синтетаза). Синтез липидов. Образование клеточной стенки (связывание пентапептида мурамовой кислоты с N-ацетилглюко- замином и присоединение пяти остатков глицина, перенос компонента клеточной стенки) |
Обмен веществ (транспортные системы), рецепция, межклеточное узнавание |
|
Цитозоль |
Гликолиз. Большинство реакций промежуточного обмена |
Гликолиз. Глюконеогенез. Биосинтез жирных кислот, сахаров, нуклеотидов, аминокислот. Активация аминокислот. Фосфоглюконатный путь. Большинство реакций промежуточного обмена |
|
Митохондрии |
- |
Транспортные системы. Превращение липидов в промежуточные продукты обмена, участвующие в дальнейших реакциях в матриксе |
|
Наружная мембрана |
- |
Использование АТР для фосфорилирования нуклеотидов |
Окончание таблицы 14
|
1 |
2 |
3 |
|
Межмембранное пространство |
- |
Цепь переноса электронов (дыхательная цепь) |
|
Внутренняя мембрана |
- |
АТР-синтетаза (сферические частицы), транспортные белки |
|
Матрикс |
- |
Цикл Кребса. Окисление пировиноградной кислоты и жирных кислот. Митохондриальная ДНК, рибосомы, РНК. Экспрессия митохондиального генома |
|
Ядро |
Нуклеоид, репликация ДНК, транскрипция |
Репликация ДНК. Транскрипция, синтез некоторых ядерных белков |
|
Ядрышко |
- |
Синтез рибосомных РНК |
|
Рибосомы |
Синтез белка |
Синтез белка |
|
Эндоплазматический ретикулум |
- |
Синтез липидов и стероидов, липидных и белковых компонентов клеточных органелл. Биосинтез липидов и гликолизирование белков (в том числе олигосахарида, связанного с аспарагином), перенос веществ |
|
Комплекс Го льджи |
- |
Модификация, сортировка, упаковка, транспорт, избирательный экспорт; круговорот мембран, образование лизосом |
|
Лизосомы |
- |
Внутриклеточное расщепление макромолекул |
|
Пероксисомы |
- |
Окислительные реакции с участием молекулярного кислорода |
Таблица 15
Классификация организмов по источникам энергии и восстанавливающих эквивалентов
|
Тип |
Источник энергии |
Окисляемое соединение - поставщик восстанавливающих эквивалентов |
Организм |
|
Фотон и тотрофы |
Свет |
Неорганические соединения (Н2О, H2S, S и др.) |
Зеленые клетки высших растений, фотосинтезирующие бактерии |
|
Фотооргано- трофы |
Свет |
Органические соединения |
Несерные пурпурные бактерии |
|
Хемолитотрофы |
Реакции окисления- восстановления |
Неорганические соединения (Н2, H2S, NH3, Fe2+) |
Водородные, серные, денитрифицирующие, железобактерии |
|
Хемоорганотрофы |
Реакции окисления- восстановления |
Органические соединения |
Животные, большинство микроорганизмов, нефотосинтезирующие клетки растений, грибы |
Каковы потребности микробных клеток в питательных веществах и как они удовлетворяются? Для построения клеточных компонентов микробная клетка нуждается, в первую очередь, в основных элементах.
Кислород и водород микробы получают главным образом из воды, а также из воздуха.
Потребности в углероде микроорганизмы удовлетворяют по-разному, и в зависимости от типа углеродного питания различают несколько групп микробов.
Автотрофы, для которых единственным источником углерода является углекислота. Энергию для этого процесса потребления углерода микробы получают за счет окисления неорганических соединений - это хемосинтезирующие автотрофы. Например, у нитрифицирующих бактерий реакция идет следующим образом:
Фотосинтезирующие автотрофы используют солнечную энергию. Эти бактерии содержат хлорофилл, каротиноиды.
Гетеротрофы, получающие углерод из органических соединений, также подразделяются на фотосинтезирующие и хемосинтезирующие. Первые используют солнечную энергию за счет своих пигментов, вторые получают энергию благодаря окислению глюкозы или азотсодержащих соединений. В свою очередь, хемосинтезирующие гетеротрофные микроорганизмы делятся на две группы: метатрофы, усваивающие углерод из мертвого органического материала, и паратрофы, использующие углерод из органических веществ живых организмов. Метатрофы являются сапрофитами, паратрофы ведут паразитический образ жизни. При этом они могут быть факультативными или облигатными паразитами. К последним относятся риккетсии, хламидии, вирусы.
Промежуточное положение между автотрофными и гетеротрофными микроорганизмами занимают прототрофные, которые усваивают углерод из органических соединений (как гетеротрофы), а азот - из минеральных веществ (как автотрофы).
По способу усвоения азота также различают несколько групп микроорганизмов: усваивающие молекулярный азот, азот из аммиачных солей, из нитратов и нитритов, из простых белков и из сложных белков.
Способностью усваивать молекулярный азот обладают лишь некоторые прокариоты. Это азотфиксирующие микроорганизмы. Фиксация азота заключается в химическом связывании свободного газообразного азота с другими элементами. Такой способностью обладают микроорганизмы, способные синтезировать фермент нитрогеназу, детерминируемый специальными nif-гена- ми. Нитрогеназа представляет собой двухкомпонентный фермент, содержащий железо, серу, молибден. Компонент I представлен белком, включающим 2 атома молибдена и 28 - 34 атома негемового железа (Mo-Fe - белок). Его функция состоит в связывании и восстановлении субстрата - молекулярного азота. Кроме того, он может связывать и восстанавливать ацетилен, цианиды. Компонент II содержит железо и серу (Fe-S - белок), то есть относится к ферредоксинам. Он дополняет компонент I электронами, а также связывает АТР и магний.
Для связывания азота требуется 6 электронов:
Энергия для этого процесса получается за счет гидролиза АТР. Требуемое количество АТР варьирует у разных бактерий. Так, виды Azotobacter требуют 4-5 молекул АТР, тогда как Clostridium pasteurianum - 20 молекул. АТР связывается с компонентом II нитрогеназы и не гидролизуется до переноса этим компонентом электронов к компоненту I.
Электроны для фиксации азота получаются в результате фотосинтетических реакций или из источников углерода (как, например, пирувата). Носителем электронов являются ферредоксины (рис. 88).
Способностью фиксировать азот обладают как свободноживущие, так и симбиотические микроорганизмы. К первым относятся аэробные представители родов Azotobacter, Beijerinckia, Azomonas, Aquaspirillum, микроаэрофилы (Xanthobacter autotrophicum, Azospirillum lipoferum, Thiobacillus ferrooxidans), факультативные анаэробы (Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aeiogenes, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii, виды Enterobacter), анаэробные представители рода Clostridium. Симбиотическую фиксацию азота осуществляют бактерии рода Rhizobium, некоторые актиномицеты (более подробно о симбиозе растений с азотфиксирующими бактериями рассказано в разделе, посвященном корню). Микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, называют нитрогенбактериями.
Рис. 88. Перенос электронов различными ферредоксинами
Большинство микроорганизмов способны усваивать азот в восстановленной форме. Исходя из этого, нитраты используются ими после восстановления до аммиака, которое осуществляется в два этапа при участии ферментов нитратредуктазы и нитритредуктазы. Ни- тратредуктаза В является молибденсодержащим ферментом и катализирует восстановление нитратов до нитритов. Нитритредуктаза, содержащая железо и серу, восстанавливает нитриты до аммиака. Действие этого фермента подобно действию нитрогеназы, так как реакция требует участия 6 электронов и не освобождает каких-либо промежуточных продуктов. Описанный процесс называют ассимиляционной нитратредукцией. По конечному результату она подобна диссимиляцион- ной нитратредукции или денитрификации. Однако между этими процессами имеются и существенные различия (табл. 16). Бактерии, усваивающие азот нитратов и нитритов, относятся к нитробактериям.
Соли аммония являются доступным источником азота для многих микроорганизмов, так как азот этих соединений может прямо использоваться при синтезе аминокислот. Бактерии, для которых источником азота являются аммиачные соли, называются аммонбактериями.
Таблица 16
Различия между ассимиляционной и диссимиляционной нитратредукцией (из М.В. Гусева и Л. А. Минеевой)
|
Признак |
Ассимиляционная нитратредукция |
Диссимиляционная нитратредукция |
|
Локализация в клетке |
В цитоплазме |
В мембранах |
|
Отношение к энергетическому метаболизму |
Не связана с получением клеточной энергии |
Связана с синтезом АТР |
|
Отношение к 02 |
Нечувствительна к 02 |
О2 ингибирует активность и репрессирует синтез NO3-и NO2- - редуктаз |
|
Отношение К NO3-и NO2- |
- |
Индуцирует синтез соответствующих редуктаз |
|
Отношение К NH3 |
Репрессирует синтез ферментов |
- |
|
Судьба конечного продукта |
Входит в состав азотсодержащих клеточных компонентов |
Выделяется из клетки |
Многие бактерии усваивают азот из простых белков - это пептонные бактерии. Наконец имеются бактерии, усваивающие азот из сложных белковых соединений.
Для построения своих структур микроорганизмам необходимы различные неорганические соли, с которыми клетка получает фосфор, серу, калий, кальций, натрий, магний, железо. Некоторые микробы требуют для своего развития присутствия микроэлементов. Минеральные вещества микроорганизмы получают из окружающей среды.
Многие микробы нуждаются в добавках специальных веществ, без которых они не способны существовать и которые не могут синтезировать сами. Это факторы роста, или ростовые факторы. К ним относятся некоторые аминокислоты, пурины и пиримидины, а также витамины. Бактерии, нуждающиеся в факторах роста, называют ауксотрофными.
Суммарные данные о питательных веществах и их назначении для микробной клетки приводятся в табл. 17.
Необходимые для питания вещества микроорганизмы получают из окружающей среды. Для культивирования бактерий в лабораторных или производственных условиях используются питательные среды, которые в зависимости от состава, консистенции, назначения являются достаточно разнообразными.
Таблица 17
Источники питательных веществ для микроорганизмов
|
Цель использования |
Вещество |
|
Строительные нужды |
Минеральные соли, газообразный азот, углекислота, факторы роста |
|
Энергетические нужды |
Газообразный водород, сероводород, тиосульфат |
|
Строительные и энергетические нужды |
Углеводы, белки, аммиак, нитриты, нитраты |
Питательные среды могут быть искусственными и естественными. К последним относятся некоторые природные субстраты, как, например, молоко, картофель, желчь, кровь, сыворотка и т. д. Искусственные питательные среды представляют собой смесь различных компонентов в достаточно расщепленном состоянии. Особое место занимают синтетические (минимальные) питательные среды, которые состоят из солевой основы с определенной pH и различных факторов роста.
Так как бактерии характеризуются широким разнообразием физиологических особенностей, приготовление универсальной искусственной питательной среды невозможно.
Питательные среды должны удовлетворять ряду требований: содержать необходимые для развития бактерий вещества в легко усвояемой форме, быть изотоничными, иметь оптимальную влажность, pH, вязкость, оптимальный окислительно-восстановительный потенциал, быть стерильными и, по возможности, прозрачными.
По консистенции питательные среды могут быть жидкими, плотными и полужидкими. Для получения плотных и полужидких сред к ним добавляют агар-агар, представляющий собой продукт переработки особого вида морских водорослей, который плавится при температуре 80 - 86°С, а затвердевает при комнатной температуре.
По назначению питательные среды подразделяются на простые (обычные), элективные, селективные и дифференциально-диагностические. Простые питательные среды предназначены для выращивания различных видов бактерий. Они представлены мясопептонным агаром, мясопептонным бульоном, пептонной водой. Элективные (избирательные) среды создают максимально благоприятные условия для роста определенных бактерий. Селективные среды содержат вещества, подавляющие рост одних бактерий и не влияющие на рост других. Дифференциально-диагностические среды создают возможность разграничить отдельные виды бактерий на основании особенностей их обмена.
Питательные вещества могут проникать в организм двумя путями: путем заглатывания, захватывания плотных частиц с последующим их перевариванием - голозойный способ; путем использования небольших по размерам молекул питательных веществ - голофитный способ. У микроорганизмов, за исключением некоторых представителей простейших (например, амебы), преобладает голофитный способ питания.
Поступление питательных веществ в микробную клетку происходит через всю ее поверхность. Основным препятствием для этого является цитоплазматическая мембрана. Через клеточную стенку в клетку свободно проникают ионы, молекулы и макромолекулы с молекулярной массой менее 600 Да. Чем меньше размеры молекул и чем они более гидрофобны, тем легче и быстрее они диффундируют через искусственный липидный бислой, не содержащий белков. Малые (18 Да) незаряженные молекулы воды быстро диффундируют через мембраны, также быстро диффундируют малые полярные молекулы (например, мочевина, СO2, глицерол), гидрофобные молекулы (O2, N2, бензол), крупные незаряженные полярные молекулы вообще не способны диффундировать (глюкоза, сахароза). В то же время через цитолемму указанные вещества диффундируют легко благодаря наличию в ней мембранных транспортных белков, специфических для каждого химического соединения. Эти белки могут функционировать по принципу унипорта (перенос одного вещества через мембрану) или котранспорта (перенос двух веществ). Последний может быть в виде симпорта (перенос двух веществ в одном направлении) либо антипорта (перенос двух веществ в противоположных направлениях). При транспорте вторым веществом является Н+. Унипорт и симпорт являются основными способами переноса в прокариотическую клетку большей части веществ, необходимых для ее жизнедеятельности.
Различают два типа транспорта: пассивный и активный. Первый не требует затрат энергии, второй - энергозависимый. Пассивный транспорт незаряженных молекул осуществляется по градиенту концентрации, транспорт заряженных молекул зависит от градиента концентрации Н+ и трансмембранной разности потенциалов, которые объединяются в трансмембранный градиент Н+ или электрохимический протонный градиент. Как правило, внутренняя цитоплазматическая поверхность мембраны несет отрицательный заряд, что облегчает проникновение в клетку положительно заряженных ионов.
В транспортных процессах прокариотической клетки основную роль играет электрохимический протонный градиент, при этом перенос идет против градиента концентрации веществ. На цитолемме эукариотических клеток с помощью натриево-калиевого насоса поддерживается мембранный потенциал. Этот насос, функционирующий как антипорт, накачивающий против градиентов концентрации К+ в клетку, a Na+во внеклеточную среду, является ферментом АТР-азой. При этом в ATP-азе происходят конформационные изменения, в результате которых Na+переносится через мембрану и выводится во внеклеточную среду, а К+ переносится внутрь клетки.
ATP-аза осуществляет также активный транспорт аминокислот и сахаров. Аналогичный механизм присутствует в цитолемме аэробных бактерий. Однако у них фермент вместо гидролиза АТР осуществляет его синтез из АДР и фосфата, используя протонный градиент. Таким же образом функционирует описанный выше бактериородопсин. Иными словами, один и тот же фермент осуществляет и синтез и гидролиз АТР.
В связи с наличием суммарного отрицательного заряда в цитоплазме прокариотической клетки ряд незаряженных молекул переносится по принципу симпорта с Н+, источником энергии является трансмембранный электрохимический градиент Н+ (например, глицин, галактоза, глюкоза), отрицательно заряженные вещества переносятся по принципу симпорта также с Н+ за счет градиента концентрации Н+, транспорт Na+ из клетки осуществляется по принципу антипорта с Н+, который переносится в клетку также за счет градиента концентрации Н+, механизм аналогичен (Na+ - К+) - насосу эукариот. Положительно заряженные вещества поступают в клетку по принципу унипорта за счет трансмембранной разности электрических потенциалов (например, аминокислоты лизин, аргинин, гистидин, К+).
У прокариот в транспорте важную роль играет векторный перенос групп, или транслокация. При этом переносимое вещество (например, сахар) фосфорилируется, а донором фосфата является фосфоенолпируват (рис. 89).
В транспорте аминокислот и сахаров участвуют также периплазматические связывающие белки, находящиеся в пространстве между цитолеммой и клеточной стенкой.
Микроорганизмы синтезируют гидрофобные ионофоры, которые повышают проницаемость билипидного слоя для различных ионов. Перенос ионов с помощью ионофоров пассивный, не требующий затраты энергии. Ионофоры облегчают ионам передвижение через гидрофобные участки мембраны по электрохимическому градиенту, по принципу диффузии. Известны два типа ионо-форов: каналообразующие и подвижные переносчики (рис. 90). И те и другие встраиваются (растворяются) в липидном бислое. Ионофорами являются некоторые антибиотики, например валиномицин (подвижный переносчик К+, Cs+, Rb+, NH4+), грамицидин, две молекулы которого образуют канал, переносящий одновалентные катионы; ионофор A23187переносит Са+ и Mg+в клетку по принципу антипорта с Н+.
Рис. 89. Активный транспорт сахаров внутрь бактериальной клетки: I - внеклеточное пространство: II - внутриклеточное пространство; 1 - сахар; 2 - фосфотрансферазная система; 3 - фосфорилированный сахар: 4 - пировиноградная кислота; 5 - фосфоенолпируват; 6 - плазматическая мембрана (по Б. Албертсу и соавт., с изменениями)
Рис. 90. Каналообразующий ионофор (1) и подвижный переносчик (2): а - транспортируемый ион; 6 - липидный биспой (по Б. Албертсу и соавт., с изменениями)
Одной из разновидностей ионофоров являются сидерофоры, синтезируемые некоторыми микроорганизмами вещества, которые связывают нерастворимое железо (Fe3+), переносят его через мембрану внутрь клетки, где железо освобождается и восстанавливается до Fe2+, которое является водорастворимым.
Таким образом, для того чтобы питательные вещества могли проникнуть в микробную клетку, необходимо, чтобы они находились в достаточно расщепленном виде. Некоторые вещества сразу проникают в клетку, так как находятся в среде в расщепленном состоянии или в стадии расщепления. Для подготовки питательных веществ к проникновению в клетку микробы выделяют во внешнюю среду ряд ферментов, гидролизующих эти вещества. Это так называемое внеклеточное переваривание.
После попадания питательных веществ в клетку дальнейшие процессы идут у всех организмов одинаково. Прежде всего происходят процессы расщепления этих веществ на небольшие фрагменты с последующим превращением их в ряд низкомолекулярных соединений (катаболизм). Эти процессы протекают с освобождением энергии и запасанием ее в АТР или в других соединениях. Из образовавшихся веществ происходит синтез сначала мономеров (строительных блоков), а затем полимеров (макромолекул). Эти процессы протекают с поглощением энергии и представляют собой анаболизм.