Генетические аспекты детской онкологии
В основе развития злокачественной опухоли лежит накопление множества нарушений в геноме клетки. Доказательства генетической основы рака и понимание механизмов превращения нормальных клеток в опухолевую были получены с помощью молекулярно-генетических исследований, основную роль в которых сыграли неоплазии детского возраста. Картирование и клонирование генов, определение частоты и спектра мутаций, идентификация генов, вовлеченных в злокачественную трансформацию и опухолевую прогрессию, стали основными в познании закономерностей организации и функционирования генома человека. К настоящему времени установлено, что гены, ответственные за злокачественную трансформацию, — это гены, структурно-функциональные изменения (мутация) которых, в конечном счете, приводят к неконтролируемому делению клетки. Главная роль в злокачественной трансформации клетки принадлежит двум классам генов: 1) протоонкогенам, которые в норме осуществляют контроль клеточной пролиферации, раннего развития, морфогенеза и клеточной дифференцировки, а в случае структурно-функциональных изменений этих генов их принято называть онкогенами; 2) генам-супрессорам или антионкогенам, кодирующим регуляторные белки и участвующим в регуляции клеточного деления, при инактивации такого гена (генов) может возникнуть бесконтрольное деление клетки. Изучение биохимической функции генов позволило Кинзлеру и Фогельштайну в 1997 г. классифицировать гены-супрессоры опухолевого роста и распределить их на две группы: гены «хранителей клеточного цикла» (gate-keepers) и гены «общего контроля» (caretakers). Мутации или структурные изменения, ведущие к нарушению функции генов «хранителей клеточного цикла», предрасполагают к развитию опухоли. Для развития опухоли необходимо повреждение (мутация или функциональная инактивация) обоих аллелей гена-супрессора. Дефекты генов «общего контроля» приводят к увеличению частоты мутаций, т. е. к нестабильности генома.
В зависимости от того, в какой клетке произошла первоначальная мутация — половой или соматической, рак может быть наследственным и ненаследственным. Выявление наследственной предрасположенности к раку и причин его возникновения открывает путь к ранней диагностике, мониторингу, таргетной терапии и профилактике этого заболевания. Ретинобластома стала первой опухолью, изучение которой позволило A. Knudson в 1971 г. предложить гипотезу двухступенчатого развития и наследования «семейных опухолей», которая в дальнейшем подтвердилась и стала классической моделью, позволившей разработать принципы изучения канцерогенеза разных неоплазий. Согласно этой модели для развития наследственно детерминированной неоплазии необходимо две мутации гена или «2 удара», одна из этих мутаций наследуется, вторая мутация или «удар» происходит в соматической клетке. Последующие молекулярные исследования подтвердили эту гипотезу и показали, что при наследственных формах опухоли начальные изменения (мутация одного из аллелей рецессивного онкогена) происходят в гамете одного из родителей, передаются потомку, и впоследствии выявляются во всех клетках его организма, в том числе и в клетках периферической крови. Возникновение мутации во втором аллеле гена уже в соматической клетке обеспечивает переход гена в гомозиготное состояние, что является причиной нарушения функции гена и последующей злокачественной трансформации.
Ретинобластома — злокачественная опухоль сетчатки глаза у детей; из 200 ежегодно диагностируемых случаев заболевания этой опухолью около 100 являются наследственно детерминированными формами.
Этиология. Причина развития ретинобластомы обусловлена мутацией гена RB1. Ген RB1 первым из класса онкосупрессорных генов клонирован в 1986 г. Этот ген локализуется на длинном плече хромосомы 13(13q14.2) и кодирует ядерный фосфопротеин (pl05-Rb). Он состоит из 27 экзонов, относится к группе «хранителей клеточного цикла» и является ключевым компонентом негативного контроля клеточного деления. Мутации гена разнообразны (делении, миссенс-мутации, нонсенс-мутации, сдвиг рамки считывания и др.) и наиболее часто встречаются в экзонах 3, 8, 18 и 20. Большой размер геномной копии гена RB1 делает трудоемким тестирование этого гена как молекулярного маркера ретинобластомной опухоли. В наследственных случаях наличие гаметической гетерозиготной мутации гена RB1 предрасполагает к мутации его неповрежденного аллеля в одной или нескольких клетках сетчатки глаза ребенка, поэтому эта форма ретинобластомы возникает в более раннем возрасте и мультифокально. У детей с герминальной мутацией гена RB1 его мутации могут возникать в других соматических клетках, поэтому имеется высокий риск развития вторых первичных опухолей. Нарушения функции гена RB1 обнаруживают во многих других опухолях, но уже как вторичные, являющиеся признаком дестабилизации генома опухолевой клетки. В ненаследственных случаях ретинобластомы обе мутации гена RB1 соматические. Такой гомозиготный характер мутации гена RB1 обнаруживается только в клетках опухолевой ткани.
Характеристика заболевания. Ретинобластома с генетической точки зрения имеет наследственную и ненаследственную формы. Наиболее часто выявляемыми симптомами являются лейкокория, косоглазие, гетерохромия радужки. Клинически выявляемая ретинобластома в 10% случаев встречается в сочетании с врожденными аномалиями. Частота семейных случаев при этой опухоли составляет 10-12%. Герминальная мутация гена RB1 присутствует практически у всех пациентов с билатеральной ретинобластомой. Односторонняя ретинобластома в 15% случаев также может иметь наследственную природу. В целом наследственные случаи составляют около 50%, среди них большую часть представляют мутации, возникшие de novo. Тип наследования — аутосомно-доминантный с варьирующей экспрессивностью и 90% пенетрантностью. Это означает, что у 90 % носителей мутации этого гена может возникнуть заболевание. Риск передачи наследственной ретинобластомы составляет 50%, а в случае унилатеральной, унифокальной и несемейной ретинобластомы риск развития заболевания у потомков достигает 2-5 %.
Особенностью клинического проявления наследственных форм ретинобластомы является ранний возраст заболевания, билатеральное поражение, характер роста опухоли, как правило, мультицентрический (67%) с преобладанием экзофитных и смешанных форм, наличие аналогичной опухоли в семье, а также обнаружение хромосомных и молекулярных аномалий гена ретинобластомы, что требует постоянного наблюдения и необходимости обследования членов таких семей. Сюда же относится «трилатеральная ретинобластома», включающая помимо билатерального поражения глаз опухоль в шишковидной железе (эпифизе), которая может возникать одновременно или спустя месяц и даже годы после диагностики ретинобластомы глаз. Пациенты с наследственной ретинобластомой склонны к развитию других опухолей, таких как остеосаркома и другие типы сарком, опухоли мозга, легкого, меланомы, опухоли молочной железы, лимфолейкоза и т. д., которые могут развиваться после лечения ретинобластомы в течение 1 года и до 40 и более лет жизни. Риск развития вторых опухолей приближается к 26%, а к 50 годам — к 36 %, поэтому важным является информировать больного ретинобластомой о наличии такого риска.
Диагностика. Медико-генетическое консультирование направлено на идентификацию наследственных форм опухоли, прогноз течения заболевания, прогноз заболевания у родственников больного и его потомства, формирование групп генетического риска и их клинико-генетический мониторинг с целью ранней диагностики и профилактики ретинобластомы. Применение цитогенетического анализа (хромосомных изменений — делений участка хромосомы 13ql4.2) позволяет выявлять наследственный характер ретино- бластомы у детей в 6-10% спорадических случаев заболевания. Молекулярно-генетическое тестирование позволяет выявлять носителей герминальных мутаций гена RB1 в 95% случаев семейных вариантов опухоли и в 30% спорадических случаев ретинобластомы. Комплексное обследование детей с ретинобластомой, включающее клинико-генетический, синдромологический, цитогенетический и молекулярно-генетический методы диагностики, является основой для ранней диагностики, индивидуального планирования лечения, определения прогноза заболевания и рекомендаций по планированию семьи родителям больного ребенка.
Профилактика. Методы ДНК-диагностики мутаций гена RB1 открывают возможность пренатальной (дородовой) диагностики на ранних сроках беременности в семьях с высоким риском развития заболевания. Возможность выявления герминальной мутации гена RB1 у плода, которая с высокой вероятностью (90%) приведет к развитию ретинобластомы, позволяет родителям планировать деторождение. В случае продолжения беременности и рождения ребенка с герминальной мутацией гена RB1 он включается в «группу риска», и при подтверждении диагноза лечение начинается на самой ранней стадии заболевания, что предполагает возможность органосохраняющего лечения. Преимплантационная диагностка мутаций гена RB1 в настоящее время уже проводится при экстракорпоральном оплодотворении.
Нефробластома или опухоль Вилмса — злокачественная опухоль, которая развивается из эмбриональной метанефрогенной мезодермы, имеет трехфазную гистологическую структуру, включая бластемный, эпителиальный и стромальный элементы. Бластемный компонент не дифференцирован, в то время как эпителиальный и стромальный компоненты существуют в различных стадиях нефрогенетического развития. Являясь наиболее распространенной опухолью у детей, нефробластома отличается высокой частотой связи с врожденными пороками развития и генетическими синдромами.
Этиология. Молекулярный патогенез до конца не установлен. Этиология нефробластомы генетически гетерогенна и включает сочетание комплекса молекулярных событий, требующихся для инициирующей трансформации первично недифференцированных клеток почки, которые и приводят в конечном итоге к формированию неоплазии. С манифестацией этого заболевания ассоциируют разные гены (WT1, WT2, FWT1, FWT2, WTX, CTNNB1) и хромосомные локусы, включающие 11р13, 11р15.5, 1p, 2q, 7р, 9q, 14q, l16q и 22. Однако к настоящему времени при опухоли Вилмса идентифицирован только один ген WT1, локализованный на коротком плече 11-й хромосомы (11р13) и относящийся к классу онкосупрессорных генов. Этот ген состоит из 10 экзонов и кодирует 24 изоформы белка, многие из которых являются фактором транскрипции и могут вызывать как активацию, так и репрессию транскрипции некоторых генов, контролируя тем самым процессы дифференцировки и роста клеток. Экспрессия гена WT1 важна в раннем эмбриогенезе для нормального развития урогенитальных зачатков и мезотелиальных тканей. Мутация в одном аллеле гена WT1 является причиной порока развития мочеполовой системы, а мутация второго аллеля гена в тканях-мишенях является ступенью на пути малигнизации клетки. Точковые мутации в гене WT1 ответственны за развитие изолированного диффузного мезангиального склероза почечной ткани с клиникой ранней хронической почечной недостаточности и за предрасположенность к развитию нефробластомы. Около 30% случаев заболевания нефробластомой является результатом инактивации гена WT1.
Характеристика заболевания. Семейные формы нефробластомы встречаются с частотой 2-3%, тип наследования опухоли аутосомно-доминантный с вариабельной экспрессивностью и пенетрантностыо (около 60%). Большинство герминальных мутаций возникает de novo. Поражение парных органов является одним из клинических критериев наследственной предрасположенности к развитию нефробластомы и выявляется у 5-10% детей с этим заболеванием. Наследственные формы нефробластомы идентифицируются у 10-30% детей, пораженных этой опухолью, чаще всего являясь компонентом наследственных синдромов.
Генетические синдромы, при которых выявляется герминальная мутация гена WT1, включают мультисистемные пороки развития и ассоциируются с опухолью Вилмса. Это синдром WAGR (Wilms Tumor, Aniridia, Genital Anomalies, Retardation), при котором помимо опухоли Вилмса могут быть аниридия, пороки развития мочеполового тракта, задержка физического и умственного развития. Причиной развития этого синдрома является гемизиготная деления региона хромосомы 11р13, в котором располагается как ген WT1, так и ген РАХб, ответственный за аниридию. В зависимости от длины делетированного участка обнаруживается полная и неполная форма этого синдрома. У пациентов с синдромом WAGR риск развития опухоли Вилмса составляет 30-50.
Синдром Дениса—Драша вызывается миссенс-мутацией в гене WT1, эти мутации почти неизменно возникают в экзонах 8 и 9 этого гена. Для синдрома характерны прогрессирующая нефропатия, псевдогермофродитизм, нефро- и гонадобластомы.
Синдром Фразье вызывается мутацией сайта сплайсинга в интроне 9 гена WT1. У больных с этим синдромом обнаруживают генитоуринарные аномалии (дисгенезию гонад, женский фенотип, мужской кариотип), часто гонадобластомы, реже нефробластомы.
Другие наследственные синдромы с меньшей частотой ассоциируются с опухолью Вилмса. У детей с синдромом Беквита—Видеманна опухоль Вилмса встречается в 5-10% случаев. При этом синдроме обнаруживается пре- и постнатальная макросомия, макроглоссия, висцеромегалия, омфалоцеле, неонатальная гипогликемия, часто встречается гемигипертрофия. Генетический механизм возникновения этого синдрома связывают с генетическими и эпигенетическими мутациями локуса хромосомы 11 р15.5, где локализованы несколько генов L1T1 (KvLQT), IGF2, Н19 и др., подверженных импринтингу. Предполагается, что в этом регионе может находиться второй ген-супрессор опухоли WT2. Описано около 20 генетических синдромов, компонентом которых могут быть опухоль Вилмса и другие эмбриональные детские опухоли, включая синдром идиопатической гемигипертрофии, синдром Симпсона— Голаби—Бемеля, синдром Ли-Фраумени и др.
Диагностика. Медико-генетическое консультирование семей, имеющих детей больных нефробластомой, направлено на выявление наследственных форм этого заболевания или идентификацию синдромов, компонентом которых она может быть, и формирование «групп риска». Идентификацию наследственных вариантов существенно затрудняет тот факт, что большинство герминальных мутаций при этом заболевании возникает de novo. Клинически предположить наследственный характер опухоли позволяют ранний возраст манифестации заболевания, билатеральное поражение, наличие еще одного члена семьи с нефробластомой, синдромы и врожденные пороки развития, ассоциированные с опухолью. Цитогенетические методы позволяют выявить хромосомную патологию у 4,5% больных и рекомендуются к проведению у всех детей с билатеральной формой опухоли Вилмса.
Профилактика. Пациенты с идентифицированным генетическим синдромом, компонентом которого может быть опухоль Вилмса или другие эмбриональные опухоли, включаются в «группу риска» с целью ранней диагностики злокачественных новообразований, своевременного лечения, а при необходимости пренатальной и преимплантационной диагностики. Мониторинг детей из «группы риска» по опухоли Вилмса обычно включает ультразвуковое и биохимическое обследование 2 раза в год и проводится до восьмилетнего возраста.
Медуллярный рак щитовидной железы. Наследственный медуллярный РЩЖ составляет около 30% всех случаев этого рака и является компонентом множественных эндокринных неоплазий 2-го типа (МЭН2). На основе сочетания клинических признаков МЭН2 были распределены на три типа: МЭН2А, МЭН2Б и семейный медуллярный РЩЖ. Синдромы МЭН2 встречаются нечасто, однако их изучение является важным для понимания канцерогенеза медуллярного РЩЖ, ранней диагностики этого заболевания, индивидуального подхода к его лечению, профилактики и для генетического консультирования.
Этиология. Мутации в гене RET являются этиологическим фактором наследственных вариантов МЭН2. Ген RET (RE-arranged during Transfection) обнаружен в центромерпом районе хромосомы 10q11.2 в 1987 г. Он состоит из 21 экзоиа и кодирует тирозинкиназы рецепторного типа (полипептиды, состоящие из 1072-1114 аминокислот), которые участвуют в контроле пролиферации, миграции и/или дифференцировке клеток разных органов, включая клетки неврального гребня. Молекула RET-белка состоит из экстраклеточной части с лиганд-связывающим доменом, трансмембранного и цитоплазматического доменов с тирозинкиназной активностью. Экстраклеточный домен RET-белка содержит цистеин-обогащенную область в непосредственной близости от трансмембранного домена. Ген RET экспрессируется в нормальных и опухолевых тканях нейроэндокринной дифференцировки, таких как С-клетки щитовидной железы, предшественниках медуллярного РЩЖ и мозговом слое надпочечников. Продукты гена RET обладают конститутивной тирозинкиназной активностью и повышенной способностью к фосфорилированию. Мутации превращают нормальный протоонкоген RET в доминантный трансформирующий онкоген, и в отличие от генов-супрессоров для развития рака достаточно мутации в одном аллеле (гетерозиготной мутации) этого протоонкогена.
Характеристика заболевания. МЭН2 являются синдромами с аутосомно- доминантным типом наследования и имеют высокую пенетрантность развития медуллярного РЩЖ. Классический синдром МЭН2А (или синдром Сиппла) ассоциируется с мультифокальным медуллярным РЩЖ, опухолью мозгового вещества надпочечников (феохромоцитомой), которая встречается у 10-60% больных. В половине случаев поражаются оба надпочечника, реже наблюдается вненадпочечниковая локализация феохромоцитомы, чаще всего является доброкачественной. Гиперплазия паращитовидных желез или одиночная аденома при этом синдроме диагностируется в 10-20% случаев заболевания. Медуллярный рак при МЭН2А чаще всего манифестирует первым и развивается между 5-25 годами. Этот синдром изредка сочетается с болезнью Гиршпрунга и кожным амилоидозом. Наиболее частые мутации, приводящие к развитию МЭН2А, представляют собой замену цистеина на другую аминокислоту в одном из кодонов: 609,611,618,620 (экзон 10) и 634 (экзон 11) в экстраклеточном домене протоонкогена RET, которые идентифицированы более чем у 98 % семей с этим синдромом.
Синдром МЭН2Б (или синдром неврином слизистых оболочек) является наиболее агрессивной формой и составляет 2-10% от всех случаев МЭН2. Симптомы те же, что и для МЭН2А, но отсутствует гиперплазия паращитовидных желез, и медуллярный РЩЖ течет более агрессивно. Этот синдром включает пороки развития скелета, невриномы конъюнктивы, слизистых оболочек губ и щек, ганглионейроматоз пищеварительного и урогенитального трактов. Такие признаки, как долихосигма, марфаноподобное телосложение и невриномы при МЭН2Б встречаются уже в первый год жизни больного. Большинство герминальных мутаций при синдроме МЭН2Б возникает de novo. Точковая мутация в кодоне 918 (экзон 16) обнаружена более чем в 95 % семей с МЭН2Б. Эта мутация (ATG > ACG) приводит к замене метионина на треонин в цитоплазматическом тирозинкиназном домене RET-белка. Другие более редкие мутации, приводящие к изменению структуры внутриклеточного домена гена RET, локализованы в кодоне 883 (экзон 15).
При семейном медуллярном РЩЖ единственным проявлением заболевания служит медуллярный РЩЖ, как правило, двусторонний и имеющий мультицентрический характер роста. Пролиферация С-клеток щитовидной железы в рамках этого синдрома расценивается как изменение, предшествующее развитию медуллярного РЩЖ. Диагноз семейного медуллярного РЩЖ включает наличие четырех и более членов одной семьи с медуллярным РЩЖ без поражения других эндокринных органов, с разным возрастом манифестации заболевания. Семейный медуллярный РЩЖ составляет 35 -40% всех случаев МЭН2, и медуллярный РЩЖ при этом синдроме имеет более благоприятное течение. Герминальные мутации при семейном медуллярном РЩЖ распределены по всей длине гена и аккумулируются в кодонах 768, 790, 791 (экзон 13) и 804, 844 (экзон 14). Еще в половине случаев семейного медуллярного РЩЖ мутации локализуются в одном из кодонов экзонов 10 (кодон 618 и 620) и 15 (кодон 891), кодирующих структуру внутриклеточного домена рецептора тирозинкиназы.
Диагностика. Медико-генетическое консультирование с применением молекулярного тестирования гена RET необходимо проводить всем пациентам с выявленным медуллярным РЩЖ и невриномами слизистых оболочек для своевременной диагностики наследственной предрасположенности к МЭН2. ДНК-диагностику следует начинать с пораженного члена семьи, в случае выявления специфической мутации тестированию подвергаются все члены семьи. Выявление бессимптомных носителей RET-мутаций среди родственников является основой для формирования «групп риска» с целью выявления потенциальных больных до появления у них клинических и биохимических признаков развития медуллярного РЩЖ, а также с целью диагностики симптомов феохромоцитомы и гиперплазии паращитовидных желез. Определение уровня кальцитонина является чувствительным методом диагностики патологии С-клеток и при обследовании лиц, отобранных при генетическом скрининге, оказывается положительным в 20% случаев в возрасте 10 лет и в 50% случаев с 13 лет. Пациенты с выявленной мутацией в гене RET должны быть информированы о заболевании, методах лечения, возможностях дородовой диагностики. Важной особенностью синдромов МЭН2 является существование определенной зависимости фенотипа от генотипа, что отражается в агрессивности течения медуллярного РЩЖ, возраста его манифестации, наличии других эндокринных опухолей. Наличие генотип-фенотип корреляции стало основой для распределения типов мутации на три уровня риска и позволило составить кодон-специфический прогноз ведения пациентов. Пациенты с уровнем риска 1 (мутации в кодонах 609, 768, 790,791,804 и 891) имеют высокий риск развития медуллярного РЩЖ. Пациенты с уровнем риска 2 (мутации в кодонах 611, 618, 620 и 634) имеют очень высокий риск, и пациенты с уровнем риска 3 (мутации в кодонах 883 и 918) имеют самый высокий риск, как для раннего развития, так и для метастазирования медуллярного РЩЖ.
Профилактика. Методом профилактики медуллярного РЩЖ является тиреоидэктомия. Кодон-специфический прогноз позволяет давать рекомендации в отношении возраста профилактической тиреоидэктомии носителям патологической мутации. У пациентов с очень высоким уровнем риска (уровень 2) тиреоидэктомию рекомендуется проводить в возрасте до 5 лет, а для пациентов с самым высоким уровнем риска (уровень 3) тиреоидэктомию рекомендуется проводить как можно раньше (предпочтительно в первый год после рождения). Для пациентов с уровнем риска 1 для возраста профилактической хирургии имеются разные рекомендации: возраст до 5 лет, до 10 лет и проведение тиреоидэктомии на основании патологических результатов биохимического исследования уровня кальцитонина, который проводится ежегодно, начиная с 6-летнего возраста. На момент первого выявления патологических результатов пентагастринового теста уже обнаруживаются микроскопические очаги медуллярного РЩЖ примерно у половины детей. Согласно типу наследования синдромов МЭН2 вероятность развития аналогичного заболевания у потомков больных составляет 50%. Выявленная мутация в гене RET открывает возможность пренатальной диагностики носительства этой мутации у плода на ранних сроках беременности в семьях с МЭН2, что позволяет родителям планировать деторождение. В случае продолжения беременности и рождения ребенка с герминальной мутацией он включается в «группу риска» и при подтверждении диагноза разрабатывается тактика его ведения в соответствии с типом выявленной герминальной мутации.
Морфологические исследования в детской онкологии
Значение роли морфолога в онкологической клинике трудно переоценить. Особенно возросла и усложнилась она за последние годы. Развивающиеся быстрыми темпами методы молекулярной биологии, приведшие к открытию онкогенов и генов-супрессоров, потребовали интеграции результатов молекулярных исследований при постановке почти любого микроскопического диагноза. Пока, безусловно, остаются в силе традиционно используемые критерии диагностики патологической анатомии, однако, вне всякого сомнения, будущее за новым направлением в онкоморфологии, где, вероятно, на передний план выступят не структурные особенности опухолевого процесса, а экспрессия специфических генов, так называемый «молекулярный портрет» новообразованной ткани. Следует подчеркнуть, что сказанное ни в коей мере не исключает необходимости соблюдения алгоритма обработки и изучения материала в ежедневной практике патологоанатомических отделений, а, наоборот, в определенной мере усложняет требования к качеству проводимых процедур, поскольку осуществление иммуногистохимических и молекулярно-генетических исследований предъявляет повышенные требования к сохранности клеток и внутриклеточных компонентов — ДНК, РНК и белков.
В общих чертах патологоанатом в процессе совместной работы с клиницистом должен выяснить нозологическую специфичность процесса, определить степень зрелости опухолевой ткани и клеток, помочь в установлении распространенности болезни, выявить возможные признаки прогностического плана и параметры, на основании которых можно подобрать адекватный вид терапии, и, наконец, оценить эффект проведенного лечения — терапевтический патоморфоз.
Процесс морфологической верификации диагноза начинается с проведения биопсии. Существует неправильная установка на эту процедуру, как на нечто очень простое и рутинное. На самом деле практика показывает, что репрезентативность полученного при биопсии материала в большинстве случаев чрезвычайно низка. При этом существует другое заблуждение, основанное на том, что большинство врачей судит о будущей информативности биопсии по размерам удаляемого участка, в то время как зачастую этот признак от размера материала не зависит. Крупные куски могут не содержать патогномоничных участков, а небольшие обрывки могут быть представлены достаточным числом диагностически достоверных клеточных структур. Поэтому проведению биопсии должен предшествовать тщательный анализ изучаемого процесса с точки зрения его возможной гетерогенности, зональности, изменения во времени и т. д. Например, при биопсировании новообразования мягких тканей с подозрением па саркому и псевдосаркоматозные заболевания всегда надо учитывать возможную зональность поражения. Следует помнить этот факт при диагностике процессов, протекающих с формированием костной ткани. При изучении биопсированного участка оссифицирующего миозита можно допустить серьезную ошибку, не зная того обстоятельства, что цен тральные участки этого процесса всегда содержат незрелые элементы, а в периферических происходит их созревание. Процесс интенсивного остеогенеза можно принять за остеосаркому. Также тщательно надо сравнивать биопсированные участки костных новообразований с рентгеновскими снимками этих процессов, чтобы иметь четкое представление о том, какому участку процесса биопсия принадлежит. Для правильной интерпретации характера самой опухоли необходимо помнить и об изменении структуры опухоли в течение определенного отрезка времени. В целом ряде случаев строение опухоли, наличие или отсутствие патогномоничных структур зависит от стадии морфогенеза опухоли. Например, саркома Капоши на разных стадиях имеет разную морфологию. На ранней стадии она вообще может быть неотличима от доброкачественных ангиоматозных разрастаний.
Одной из важнейших составных частей процесса морфологической диагностики является информация о клинических особенностях болезни. Несмотря на многократные обсуждения данной проблемы, клиницист в большинстве случаев ограничивается чрезвычайно краткими констатациями, такими как «опухоль нижней трети бедренной кости», «забрюшинная опухоль» и т. д. Однако кроме тщательной характеристики самой опухоли, ее топики, макроскопических особенностей роста, решающее значение имеют, особенно у детей, анамнестические данные, сведения о наличии семейных и наследственных случаев опухолевых заболеваний и других неопухолевых процессов у данного пациента. Число сложных, сочетанных синдромов, в состав которых входит та или иная опухолевая нозология, все время увеличивается, а описание этих синдромов, включающих разные уродства, нарушения формообразовательных процессов, системные поражения, к сожалению, в направлениях в патологоанатомическое отделение никогда не фигурирует. Например, даже такой простой симптом, как наличие кожных пигментированных участков «café au lait» (кофейные пятна), сочетающийся с нейрофиброматозом, в направлении фиксируется крайне редко.
Сложности выявления, например, парнеопластических гормональных синдромов заключаются в том, что их надо тщательно искать исходя из целого ряда симптомов, о которых пациенты, особенно дети, рассказать не могут.
Весьма важным разделом морфологического исследования является срочное гистологическое исследование. Изучение замороженного материала с помощью современных методик дает возможность судить о характере процесса с достаточно высокой долей достоверности за короткий период в течение оперативного вмешательства. Однако следует отметить, что за последние годы число срочных исследований несколько снизилось во всем мире. Точнее, изменилась инфраструктура материала, подлежащего интраоперационному исследованию. Прежде всего, наблюдается отход от таких задач, как установление гистогенеза опухоли, решение вопроса о злокачественности процесса (особенно при опухолях молочной железы). На смену срочному исследованию приходит дооперационная core-биопсия. Зато расширилось использование замороженных срезов для установления степени распространенности процесса, проверки абластичности краев резекции и др. В любом случае, результаты этого исследования необходимо оценивать осторожно и не требовать от патолога категоричности в формулировке диагноза. Всегда надо помнить, что диагноз срочного гистологического исследования является ориентировочным диагнозом.
Определенные проблемы связаны с установлением факта наличия опухолевых клеток по линиям операционных разрезов. Совершенно недопустимо формулировать микроскопические находки фразами типа «по линии резекции имеются опухолевые клетки» и тем более на этом основании делать повторные резекции. Необходимо помнить, что возможность рецидивирования из-за нарушения абластики зависит не только от факта присутствия опухолевых клеток по линии резекции, но и от их количества. Небольшое, единичное скопление опухолевых клеток может подвергнуться элиминации в ходе репарации процесса. Считается доказанным, что опухолевые клетки в поверхностных слоях стенок полого органа (например желудка) не влияют на дальнейшее прогрессирование и рецидивы процесса, в то время как в глубоких (мышечных) слоях их наличие прогностически весьма неблагоприятно. К сожалению, не всегда патологи дискриминируют в своих ответах, где находятся опухолевые клетки — в строме органа или в просвете кровеносных или лимфатических сосудов. Основное внимание заслуживают клетки, которые находятся в тканях, вне сосудов.
Материал, полученный уже после оперативного вмешательства, является основным опорным материалом для верификации окончательного диагноза. Тем более важной, иногда неоценимой, является правильная оценка макроскопических особенностей процесса.
Сделать это следует при макроскопическом изучении, описании удаленного препарата. Необходимо, чтобы описание препарата проводили совместно патолог и клиницист. Как бы детально хирург не заполнил направление на морфологическое исследование, оно никогда не заменит его живых комментариев, которые во многом проясняют морфологу не только основные особенности процесса, но и помогают выделить то множество интересных деталей, учет которых даст возможность по-новому и глубже трактовать характер поражения органа, не говоря уже о том, что в условиях опухолевого роста топографические особенности часто нарушаются и многие анатомические детали трудно выявляемы.
Трактовка микроскопической структуры опухолей у детей практически не отличается от диагностического алгоритма, применяемого при изучении новообразований у взрослых. Безусловно, детские опухоли во многом отличаются от их аналогов у недетской популяции. Во-первых, по своей инфраструктуре. Наиболее частые опухоли у детей — это лейкозы, новообразования ЦНС, нейробластомы, опухоль Вилмса почки, саркомы. Одной из характерных черт детских опухолей является связь с эмбриональными структурами, граница между которыми порой трудно устанавливается: нефробластоматоз-нефробластома, гепатобластома, сиалобластома. Педиатрические опухоли склонны к спонтанному созреванию (нейробластома). Однако принципиальной разницы в диагностических подходах к детским и взрослым опухолям не существует.
До настоящего времени диагноз в онкоморфологии ставится по нозологическому принципу, хотя в последние годы основы этого принципиального подхода заметно пошатнулись. Разберем эту тенденцию на конкретном примере. Постановка такого диагноза, как гастроинтестинальная стромальная опухоль (GIST) окончательно происходит на основании обнаружения мутации в области гена c-kit на длинном плече хромосомы 4 (4q12). Но эта мутация может выявляться в клетках целого ряда новообразований, начиная от лейкозов и заканчивая нейрофибромой. Тогда возникает вопрос, может ли считаться нозологически GIST самостоятельным заболеванием, если единственный патогномоничный признак находится за пределами морфологического параметра? Известно, что лечение гастроинтестинальных стромальных опухолей основывается на применении таргетной терапии, назначение которой всецело зависит от наличия мутации c-kit. Таким образом, с клинических позиций предпочтительнее смешанный, морфомолекулярный, а не формально морфологический подход. Это не означает, что кончилась эра описательной традиционной морфологии. Во-первых, большинство диагнозов, именно в прикладном клинико-морфологическом аспекте, основываются на традиционно используемых дескриптивных параметрах, поэтому от них отказываться рано. Во-вторых, в настоящее время проводятся исследования с уже конкретными результатами, которые дают возможность идентифицировать эквивалентные молекулярно-генетическим находкам микроскопические признаки, которые вполне могут быть применены в ежедневной клинической деятельности. Так, удалось аппроксимировать молекулярный портрет молочной железы к нуждам патоморфологических лабораторий. При изучении геномных особенностей рака молочной железы были выделены 5 типов, имеющих определенные экспрессионные профили. Установление этих разновидностей доступно пока только единичным лабораториям в мире, однако выяснилось, что с помощью более простых методов, сочетающих традиционные микроскопические параметры и ИГХ-реакции, можно выделить группы, эквивалентные подвидам молекулярного портрета рака молочной железы.
Одним из плодотворных направлений современной морфологии является изучение клеточных взаимодействий в опухоли. Это направление исходит из допущения, что клиническое поведение опухоли, ее доброкачественность или злокачественность зависят не только от характеристик самих опухолевых клеток, а от их взаимодействия с другими, на первый взгляд, неопухолевыми клеточными элементами. Это развивающееся быстрыми темпами направление о микроокружении опухолевых клеток постепенно обрастает весьма достоверными микроскопическими данными, имеющими непосредственное прикладное диагностическое и прогностическое значение. Так, уже общепризнано значение гистиоцитарных инфильтратов в пролиферирующих лейомиомах матки, как показателя малигнизации опухоли. В педиатрической онкологии наиболее перспективными с этих позиций являются поиски морфогенетических особенностей нейробластомы. Как известно, нейробластома, одна из наиболее распространенных злокачественных опухолей у детей, в своем морфогенезе проходит несколько фаз и может вызреть в ганглионейрому. Зависит ли эта способность к повышению дифференцировки от самих нейробластов или является результатом клеточных взаимодействий — вопрос до конца не решенный, однако все больше аргументов, свидетельствующих в пользу предположения о том, что условия и микроокружение для созревания нейробласта создают клетки Шванна, число которых нарастает по мере трансформации опухоли в сторону ганглионейромы. При кажущейся однозначности этого утверждения оно требует в клиническом аспекте иного методического диагностического подхода. Необходимо в каждом конкретном случае путем специальной окраски учитывать долю стромальных, шванновских элементов и популяции нейробластов.
До сих пор клиницисты и патологоанатомы прилагают огромные усилия для нахождения параметров, которые могли бы помочь в индивидуализации прогноза опухолевого заболевания. Пока для этой цели используется понятие о степени злокачественности опухоли — grade (G), введенное в онкологию A. Broders почти 100 лет назад, в 1921 г. В изначальном виде ученый выделял 4 степени злокачественности (0, 1, 2, 3) в зависимости от числового соотношения зрелых и незрелых клеток. В последующем эта принципиальная схема подверглась детализации для разных нозологических единиц, обогатилась новыми параметрами и стала включать уже новые иммуногистохимические и молекулярно-генетические показатели.
Установление степени злокачественности требует соблюдения целого ряда условий. Во-первых, ее нельзя использовать для характеристики опухолей промежуточной степени злокачественности, например, для атипической фиброксантомы. Существуют злокачественные опухоли, которые не подлежат классификации по степеням, например, дедифференцированная липосаркома. Нельзя определять G после терапии, в том числе XT, поскольку лечение может изменить как морфологию клеток, так и митотический режим. Для установления G необходимо достаточное число срезов, поэтому следует избегать ставить G на соrе-биопсиях. Очень важным условием является также соблюдение режима фиксации. После неадекватной фиксации в опухолевой ткани могут не сохраняться митотические фигуры.
Тенденция последних лет — разрабатывать G для отдельных гистогенетических разновидностей, опухолей разных органов. Например, для сарком существуют две системы: Национального онкологического института в США и так называемая французская. Первая включает гистологический тип и подтип опухоли, локализацию, объем некротических участков, клеточный и ядерный полиморфизм, митотический индекс. Французская система состоит из 3 параметров: степени дифференцировки, митотического индекса и объема некротических участков.
Специальные системы разработаны для педиатрических опухолей. В онкопедиатрии главное — гистологический тип, а не степень дифференцировки опухолевых клеток. Например, все ботриоидные и веретеноклеточные рабдомисаркомы обладают высокой степенью зрелости, в то время как альвеолярная РМС — низкой степенью.
Специальная система предложена для нейробластомы. Самая популярная из них — классификация по Shimada. Схема включает возраст, степень дифференцировки нейробласта, наличие или отсутствие шванновской стромы (бедная или богатая стромой), нодулярный характер роста, индекс митоз- кариорексис (соотношение митотически делящихся клеток к числу клеток, подвергающихся кариорексису, рассчитанному на 5 000 клеток). Низкий индекс — меньше 100 клеток, промежуточный — 100-199 клеток, высокий индекс — 200 клеток и более. На основании указанных параметров выделяются две группы благоприятной и неблагоприятной гистологии.
Является ли показатель степени зрелости опухоли параметром, реально отражающим прогноз злокачественного процесса? В изолированном виде — нет. При прочих равных клинико-морфологических параметрах, как один из важных показателей, — да. Тем не менее следует предостеречь от переоценки значения этого показателя в прогностическом плане. Причина этого факта кроется в следующем. На заре становления онкоморфологии было введено понятие дифференцировки — термин, используемый в нормальной гистологии для обозначения процесса постепенного нарастания разницы в морфологии между камбиальными базальными и зрелыми поверхностными элементами многослойного эпителия. «Слепой» перенос указанной аналогии в патологическую анатомию породил концептуальную ошибку, поскольку в огромном большинстве случаев источник клеточного генеза опухолей неясен. Если морфолог при оценке микроскопической структуры нейробластомы имеет точку отсчета и судит о степени зрелости опухолевых клеток в ряду нейробласт — ганглиозная клетка с помощью вполне апробированных параметров, то любые суждения о степени дифференцировки ряда круглоклеточных сарком носят умозрительный характер, поскольку клеточный источник этих опухолей пока не уточнен. То, на чем основывает патоморфолог свое заключение о степени дифференцировки опухоли (в данном случае саркомы), является, скорее, оценкой клеточного полиморфизма опухолевой клетки, а не реально произошедших в ней процессов созревания. С позиций современных достижений молекулярной биологии понятие о степени дифференцировки опухолевых клеток вообще лишается теоретического базиса. Считается доказанным, что любая клетка человека содержит полный набор генов. Разница между клетками состоит только в форме экспрессии этих генов, степени их метилирования. Деметилирование какого-нибудь гена и приводит к его активированию и синтезу целого ряда веществ, которые ответственны за развитие в клинике так называемых паранеопластических, эктопических синдромов. Секреция адренокортикотропного гормона в опухолях легкого, хорионического гонадотропина (ХГ) в раке желудка и т. д. Тем не менее в клинической патологии сохраняется этот параметр, хотя его прогностическая ценность весьма относительна, и группа опухолей, для которых она в реальности может быть применена, совсем незначительна. Это, скорее всего, характеристика некой внешней структурной организации опухолевой ткани, чем показатель ее биологической сущности.
Одной из важнейших задач, выполняемых патологоанатомом в онкологической клинике, является оценка проведенного лечения, установление лечебного патоморфоза. Мнение о целесообразности и информативности получаемых при этом результатов чрезвычайно разнится, вплоть до полного отрицания значения этого параметра. Попытаемся разобрать проблемы, связанные с этой процедурой. Первое, что следует помнить как клиницисту, так и патологу, — это то, что лекарственный патоморфоз определяется в той части опухоли, которая осталась после терапии. Нередко патолог не видит никаких существенных изменений в опухолевой ткани после лечения, а клиницист доказывает, что опухоль в процессе лечения сократилась вдвое. Дело в том, что, во-первых, объем опухоли сокращается за счет резорбции реактивно-воспалительных явлений в опухоли, а во-вторых, если в процессе отмирания опухолевых клеток происходит их своевременная и быстрая элиминация за счет активности фагоцитирующих элементов, то, естественно, учитывать их количество невозможно. Таким образом, степень терапевтического патоморфоза — это степень вторичных изменений в персистирующих структурах опухоли. Предложены самые разнообразные градации посттерапевтических изменений. Обычно они делятся на 3-4 степени. Высшая, четвертая, степень патоморфоза — это полное исчезновение опухоли на фоне воспалительно-резорбтивных изменений. В подобных случаях следует обязательно подтверждать диагноз предшествующей терапии биопсией. Также относительным понятием является патоморфоз первой степени. Дистрофические и незначительные некробиотические изменения, составляющие понятие первой степени патоморфоза, трудно отдифференцировать от неспецифических, спонтанно происходящих регрессивных явлений в опухолевой ткани. По существу, наиболее достоверными являются признаки второй и третьей степени. Вторая степень патоморфоза — это частичное исчезновение паренхимы опухоли, а при третьей степени обнаруживаются небольшие группы опухолевых клеток с выраженной воспалительно-фиброзной реакцией организма.
Принципиальным недостатком критериев терапевтического патоморфоза является невозможность уловить и регистрировать тонкие изменения на субклеточном уровне, невидимые в микроскопе, поскольку многие химиотерапевтические вещества влияют на такие ультраструктурные признаки, как конфигурация ДНК, синтез РНК и т. д. Возможно, что те грубые вторичные изменения, на которые мы опираемся при определении степени патоморфоза, не охватывают всего спектра структурных изменений, наступающих под влиянием лечения. Тот факт, что воздействие на опухолевые клетки не ограничивается только деструктивными изменениями, а может проявляться изменением определенных функций клеток, хорошо демонстрируется при применении прогестинов в процессе лечения рака эндометрия. Чувствительные опухолевые клетки начинают гиперпродукцию слизи, подвергаются эпидермизации и т. д. Необходимость других подходов к оценке терапевтического патоморфоза совершенно очевидна, особенно в связи с введением в онкологическую клинику таргетных препаратов, влияющих на еще более глубинные и тонкие регуляторные механизмы роста и деления клеток.
Огромным шагом вперед в морфологической диагностике опухолей явилось введение в патологическую анатомию методов иммуногистохимического (ИГХ) исследования, широкое внедрение которых стало возможным после разработки метода гибридом и наступило с начала 1980-х гг.
ИГХ-исследование основывается на принципе визуализации антигенов с помощью соответствующих антител, меченных ферментами. В нашей стране обычно используются антитела, меченные пероксидазой. Нанесенное на срезы антитело связывается с антигеном и, при последующей обработке хромогеном (диаминобензидином), который вступает в реакцию с ферментной частью полученного комплекса, образуется окрашенный продукт (в данном случае коричневого цвета). По интенсивности окраски этого продукта можно судить о количестве искомого антигена и, самое главное, о его точной локализации в клетке.
Число антигенов, визуализируемых с помощью ИГХ-исследования, огромно. Применение специфических антител дает возможность открыть в клетке элементы цитоскелета (виментин, десмин, разновидности актина), продукты секреции (меланин, гормоны), компоненты мембраны и огромную группу веществ, маркеров дифференцировки — кластеров дифференцировки (CD), характерных для целых линий клеток, особенно важных для идентификации элементов гемопоэтической направленности — диагностики разновидностей лимфом, для их иммунофенотипирования.
ИГХ-исследование стало чрезвычайно популярным и результативным. Однако одновременно наметилась тенденция, которая заключается в некоторой переоценке его значения. Причины, которые часто не учитываются при интерпретации результатов ИГХ-исследования, следующие.
1. ИГХ-реакции в подавляющем большинстве случаев проводятся на материале, который прошел фиксацию, заливку в парафин. Антигенные структуры, которые должны вступить в реакцию со специфическими антителами, в результате вышеуказанной процедуры видоизменяются и нуждаются в дальнейшем восстановлении. С этой целью материал, препараты со срезами, дополнительно обрабатываются (в микроволновой печи, в специальных растворах, при определенной высокой температуре и т. д.), после чего они становятся пригодными для дальнейшего изучения. На данном этапе подготовки срезов можно допустить ошибку — недоработать, передержать срезы, разрушить эпитопы (локусы, вступающие в реакцию) и исказить результаты реакции, т. е. получить ложноотрицательные результаты.
2. Не все эпитопы строго и высокоспецифичны. Неспецифичные положительные реакции при ИГХ-исследовании обычны. Требуется обязательное введение в реакционную систему контрольных срезов, как положительного, так и отрицательного.
3. Наиболее важная причина ошибочных заключений кроется в абсолютизации целого ряда маркеров, выявляемых при ИГХ-исследовании. Дело в том, что за определенным антигеном, открытым в клетках определенной направленности дифференцировки, часто закрепляется ярлык маркера именно этой дифференцировки. По мере же расширения спектра применения этих антител выясняется, что этот же антиген присутствует в тканях иного гистогенеза, иногда совершенно неродственного, что затрудняет трактовку и установление тканевого и клеточного источника опухоли и приводит иногда к диагностическим ошибкам. Например, НМВ-45 — антиген, считавшийся строго специфичным для меланомы, стали выявлять в ряде опухолей почек и печени. Вначале без всякого основания эти опухоли стали диагностировать как меланомы. Только после анализа большого числа наблюдений выяснилось, что все эти новообразования гистологически принадлежали к четко очерченной группе — ангиомиолипоме. В настоящее время уже стало рутинным выявлять признаки синтеза меланина в определенных клетках этой нозологии, что никак не дает основания расценить их как меланому. Бывает и другая ситуация. Какой-нибудь антиген вначале предлагается как специфичный маркер той или иной дифференцировки. Наиболее типичный пример — мезотелиома и ее маркеры. По мере изучения материала других локализаций, опухолей другого гистогенеза выявляется, что данный антиген (скажем, кальретинин) содержится и в клетках рака молочной железы и легкого.
Это не значит, что надо отказаться от ИГХ-исследования. Во-первых, следует интерпретировать полученные результаты не формально, а в контексте клинических, общеморфологических данных. Во-вторых, всячески следует стремиться ставить ИГХ-реакции в виде широкой панели антигенов, которые, в определенной мере, выполняют функцию контроля по отношению друг к другу, и дополнять, в ряде случаев, биохимическими исследованиями крови. Например, при сомнительных ИГХ-результатах на хромогранин, альфа-фетопротеин (АФП) и ХГ очень желательно определить эти вещества и в периферической крови.
Важнейшим завоеванием современной онкоморфологии явилось внедрение в ежедневную практику методов молекулярно-генетических исследований. Прежде всего это относится к реакции флуоресцентной in situ гибридизации — FISH (fluorescent in situ hybridization) реакции.
Как видно из названия, метод основывается на трех принципиальных положениях. Для проведения реакции должно произойти связывание (гибридизация) флуоресцирующей специфической пробы в условиях фиксированного (in situ) субстрата — это цитогенетическая техника, которая используется для детекции и локализации присутствия или отсутствия специфических ДНК- последовательностей на хромосомах. Для этого метода используются флуоресцентные пробы, которые связываются только с теми участками хромосом, к которым у них имеется высокой степени общность последовательностей. Установление факта наличия или отсутствия связывания пробы с хромосомным участком происходит во флуоресцентном микроскопе.
Фабричным или лабораторным методом готовится проба, содержащая нужную последовательность нуклеотидов, и метится флуоресцентными красителями. Исследуемый материал, содержащий ДНК, подвергается обработке для частичного разрушения ее молекулы с целью разрыва двухцепочечной структуры и, тем самым, облегчения доступа к искомому участку гена. Пробу и исследуемый материал выдерживают при определенной температуре (обычно 37°) несколько часов (ночь). За этот период проба должна связаться с ДНК — гибридизоваться. После этого излишек пробы отмывают и препарат изучают во флуоресцентном микроскопе, снабженном набором фильтров, сконструированных с учетом волн возбуждения и поглощения, характерных для тех флуоресцентных красителей, которые имеются в пробах.
При кажущейся простоте эта методика чрезвычайно сложна и требует очень детальной отработки всех компонентов и стадий подготовки материала.
Стекла, на которых прикреплены срезы, мазки и т. д., для реакции должны быть тонкими и, самое главное, очень тщательно промытыми детергентами и храниться так, чтобы на них не оседала пыль. Последняя может содержать микробы, которые неспецифически поглощают красители и вызывают неустранимые фоновые свечения. Лучше хранить их в спирту (метиловом) и доставать по мере надобности.
Материалом для FISH-реакции служат парафиновые срезы тканей, мазки и отпечатки, в том числе мазки и осадки центрифугатов всевозможных жидкостей — моча, асцит, спинномозговая и амниотическая жидкости, сперма и др.
FISH-реакция используется и для изучения структуры РНК, а также гетерологического чужеродного материала для человека — ДНК- и РНК-вирусов (Эпштайн—Барр, папилломатоза человека и др.).
Для проведения качественной реакции необходимо иметь четкие сведения о фиксации материала. Частицы тканей, фиксированных формалином, вполне пригодны для этих целей, но следует помнить, что длительность формалиновой фиксации отрицательно влияет на результаты реакции, однако и из длительно фиксированных тканей тоже можно получить убедительные результаты, главное знать об этом. Зная о том, сколько примерно фиксировали ткани в формалине, можно соответствующим образом изменить режим демаскировки.
FISH-реакция дает возможность регистрировать изменения в молекуле ДНК, произошедшие в результате увеличения копийности гена — амплификации, потери гена — делеции, изменения числа хромосом, а также качественные изменения — перемещения локусов генов как в пределах одной и той же хромосомы (инверсии), так и между двумя хромосомами — транслокации.
Кроме традиционных, уже описанных методик реакции, как в исследовательскую, так и в диагностическую жизнь внедряются и новые специальные методические наработки и целые направления по изучению и диагностике геномных нарушений. Из этих направлений следует отметить следующие.
Сравнительная геномная гибридизация. Этот метод позволяет провести своего рода скрининг всего генома без предварительного знания, в каких участках могут быть нарушения. Его огромным достоинством является отсутствие необходимости получения метафазных хромосом исследуемой ткани и клеток, достаточно иметь ДНК исследуемого материала.
Для проведения сравнительной геномной гибридизации получают ДНК из клеток определенной ткани и метят любым флуоресцентным красителем. Параллельно производят мечение нормальной ДНК. Многие предпочитают для этой цели брать ДНК из клеток крови того же больного. Отдельно следует приготовить метафазные пластинки с нормальными хромосомами, а дальше ДНК гибридизуют на этих хромосомах. Сравнение интенсивности сигнала флуоресценции позволяет судить об изменении в геноме исследуемой ДНК. Обычно метод дает хороший результат, если очаг перестройки генома не меньше 5-10 Мб оснований. Анализ результатов следует проводить в эпифлуоресцентном микроскопе с обязательным использованием специальной компьютерной программы. Метод очень тонкий, требует хорошо подготовленных хромосомных препаратов без накладывания и перекрытия хромосомами друг друга.
Применение FISH-реакции при отдельных опухолевых заболеваниях у детей
Хронический миелолейкоз (ХМЛ). Это первое опухолевое злокачественное заболевание человека, связь которого с цитогенетическим нарушением была доказана убедительно. В I960 г. два ученых из США Р. Nowell и D. Hungerford открыли наличие у больных с ХМЛ специфической хромосомы, названной по месту проводимых исследований — филадельфийской хромосомой (Ph). В настоящее время установлено, что генез филадельфийской хромосомы связан с транслокацией, происходящей между 9-й и 22-й хромосомой. При реципрокной транслокации на 22-й хромосоме формируется новый ген, кодирующий белок, обладающий тирозинкиназной активностью и определяющий злокачественность процесса. Идентификация этого слитного гена является задачей реакции и входит в состав рутинных наборов диагностики ХМЛ. При этом важное значение приобрел не только качественный, но и количественный учет ядер с транслокацией t(9;22)(q34;qll), поскольку динамика числа таких ядер используется для оценки эффективности терапии, а также для раннего выявления рецидива болезни (молекулярный рецидив).
Эту реакцию можно ставить на мазках крови, на пунктатах костного мозга и даже (редко) на срезах. Поиски можно вести как на интерфазных ядрах, так и метафазных пластинках. Обычно в лабораторию доставляют пунктаты костного мозга.
Nmyc (MYCN). Nmyc является представителем семейства генов туе (myelocytomatosis viral related oncogene) и кодирует локализующийся в ядре белок, относящийся к транскрипционному фактору. Находится этот ген на коротком плече второй хромосомы (2р24.1).
Особое значение он приобрел после того, как в работах М. Schwab’a, H. Е. Warmus’a и J.M. Bishop’a была выявлена роль продукта этого гена в прогнозе нейробластомы. Ген MYCN амплифицирован примерно в 20-25% нейробластом, чаще на поздних стадиях, и является прогностически неблагоприятным фактором, обусловливающим химиорезистентность опухолевых клеток.
До сих пор нет четких количественных параметров для оценки степени амплификации гена Nmyc. Вначале выделяли амплификацию низкой и высокой степени, принимая за амплификацию наличие даже трех лишних копий гена. В настоящее время склоняются к числу 10 (при 2 центромерных сигналах), но, на наш взгляд, в амплифицированном состоянии сигналов должно быть еще больше.
Небольшое число копий гена Nmyc может быть не связано с амплификацией этого гена. Во-первых, иногда формируются изохромосомы 2р, а во- вторых, происходят несбалансированные транслокации короткого плеча второй хромосомы.
Несколько моментов, которые должны быть учтены специалистом, проводящим FISH-реакцию при нейробластоме.
1. Ганглионейрома не сопровождается амплификацией гена Nmyc, поэтому не является объектом изучения, хотя некоторые клиницисты по незнанию настаивают на этом.
2. Очень осторожно надо оценивать результаты исследования ганглио- нейробластомы. Микроскопическая структура этого варианта чрезвычайно пестрая и требует детального изучения каждого случая на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Регистрировать сигналы следует в мелких округлых ядрах незрелых клеток. Более крупные клетки, созревающие в ганглиоциты, проходят стадию полиплои- дизации и без строгого учета числа центромерных сигналов могут быть ошибочно расценены как клеточные элементы с амплификацией гена Nmyc.
3. В случае динамического наблюдения за больными желательно провести FISH-реакцию на материале, полученном на разных этапах лечения пациента — рецидивах, метастазах. Анализ состояния гена Nmyc в динамике позволяет более объективно оценить прогностическое значение этого фактора, что, самое главное, должно производиться в контексте всей микроскопической картины болезни на конкретном ее этапе. Имеются наблюдения, когда различалось число копий гена Nmyc в рецидивных опухолях и метастазах по сравнению с первичным очагом болезни.
В клиническом аспекте следует также помнить, что не всегда степень амплификации (вплоть до ее отсутствия) коррелирует с прогнозом. Во многом такие расхождения обусловлены степенью экспрессии гена на уровне РНК или белка.
Для установления прогноза при нейробластоме используется и другая реакция, выявляющая делецию короткого плеча 1-й хромосомы (1рЗб). Результат этой делеции прогностически весьма неблагоприятен, поскольку предположительно связан с потерей пока не идентифицированного гена-супрессора, локализующегося в этом участке.
На тканевых срезах результаты не очень демонстративны (нужно сосчитать большое число не перекрывающих друг друга ядер). В тех случаях, когда это возможно, лучше проводить реакцию па мазках-отпечатках. Особое значение придают результатам этой реакции для предсказания рецидивов опухоли.
Проба на увеличение числа копий 17q, также характерного для нейробластомы, на практике применяется редко.
Транслокации при саркомах мягких тканей
Синовиальная саркома — одна из часто встречающихся мягкотканных опухолей человека. Название этого новообразования является чисто историческим, поскольку связь опухоли с синовиальной оболочкой в настоящее время окончательно отвергнута. Более того, синовиальная саркома — единственная опухоль, нозологическая спецификация которой происходит с учетом генетических нарушений, в частности специфической транслокации между 18-й и женской половой хромосомой t (X; 18)(pi 1 ;ql 1).
При синовиальной саркоме в транслокации участвуют ген SYT, локализующийся на длинном плече 18-й хромосомы, и гены SSX1 (варианты SSX2, SSX4), являющиеся представителями семейства генов, находящиеся на X хромосоме и отличающиеся друг от друга точкой разрыва. Слитный химерный ген, формирующийся при транслокации, кодирует белок, являющийся регулятором транскрипции, который активирует протоонкогены или ингибирует супрессоры. Клинико-биологические свойства синовиальной саркомы определяются продуктом новообразованного химерного гена. Доказано, что морфологический вариант синовиальной саркомы зависит от варианта гена SSX, участвующего в транслокации. При наличии в слитном гене SSX1 опухоль обычно имеет бифазное строение. В монофазной опухоли возможны любые варианты гена SSX. Транслокация встречается в 90% случаев. В крупных лабораториях для диагностики синовиальной саркомы используют метод RT-PCR, что значительно повышает точность диагностики.
Саркома Юинга (СЮ) является мелкоклеточной круглоклеточной саркомой, входящей, совместно с ПНЭО, круглоклеточной десмопластической опухолью и другими опухолями, в семейство СЮ. Для всех указанных новообразований характерна транслокация t(ll;22)(q24;ql2), встречающаяся в 85% случаев. При этой транслокации происходит слияние гена EWS, локализующегося на 22-й хромосоме, с геном FLI1, находящегося на 11-й хромосоме. Эта транслокация реципрокная, и дериватный ген может формироваться на обеих хромосомах. Белок, кодируемый дериватным геном, имеет множество функций, хотя основная заключается в активации транскрипционной активности. Следует отметить, что ген EWS транслоцируется в 90% случаев с FLI1, но в остальных случаях может поменяться местами и с другими генами, например ERG, ETV1, FEV, E1AF.
Проба на эту транслокацию чрезвычайно точна и чувствительна. Реакцию можно ставить на срезах, на мазках, достаточно даже иметь в мазке пару десятков клеток.
Иногда в ядрах, наряду с типичной картиной транслокации, можно увидеть большое число оранжевых сигналов. Это — амплифицированные участки проксимального отдела гена EWS. Данная амплификация придает своеобразие как клинической симптоматике, так и чувствительности СЮ к XT. Эти опухоли резистентны к классическим химиотерапевтическим схемам и требуют более энергичной терапии. Часто их рентгенологическая семиотика лишена типичных проявлений в виде луковичного периостоза и больше похожа на метастатическое поражение кости. Наличие указанной амплификации необходимо обязательно отметить в ответе патолога.
FISH и герминогенные опухоли. Чрезвычайно своеобразным признаком, ассоциированным с герминогенными опухолями детей, является патология хромосомы 12. Нарушения этой хромосомы при герминогенных опухолях носят двоякий характер. Могут формироваться изохромосомы 12, с удвоением короткого плеча и одновременной потерей длинного плеча (і12р), возможна также амплификация генетического материала короткого плеча этой хромосомы. Первоначально считалось, что наличие этих нарушений свидетельствует о высокой степени злокачественности герминогенных опухолей, например, повышенной склонности к метастазированию семиномы или дисгерминомы. Большую диагностическую ценность имеет обнаружение названных нарушений в ткани яичка в структурах подозрительных на рак in situ яичек. В последнее время делаются попытки использования выявления нарушений на 12-й хромосоме для дифференциальной диагностики герминогенных и негерминогенных опухолей. Тем не менее эта проба пока еще не вошла в ежедневную клиническую практику. Причин этому несколько. Во-первых, клиницисты не очень хорошо знакомы с данными цитогенетическими нарушениями. Во-вторых, коммерческая проба признается не всеми специалистами, а предпочтение отдается синтезированным в лаборатории пробам, что затрудняет последующее стандартизированное сравнение результатов, и, наконец, клинический аспект разницы двух феноменов — формирования изохромосомы 12р и амплификации генетического материала на коротком плече этой хромосомы не до конца ясен. По состоянию вопроса на текущий момент считается, что изначально наступает амплификация генетического материала на коротком плече хромосомы 12, позже теряется длинное плечо и удваивается короткое плечо. Таким образом, оба процесса являются как бы звеньями одной и той же цепи. Действительно, во многих герминогенных опухолях, например, в семиноме у одного и того же индивидуума, выявляются оба типа нарушений.
Использование этой пробы кажется перспективным, однако требуется накопление определенного числа клинических наблюдений с последующим анализом отделенных результатов лечения этих больных. Следует помнить также о том, что эта проба используется для диагностики врожденной патологии у детей с синдромом Ballister—Killian’a (тетрасомии 12-й хромосомы с формированием изохромосомы 12р).
Диагностика пола необходима не только для характеристики пограничных состояний у больных с герминогенными новообразованиями гонад. В последнее время появилась проба на участок SRY (sex determining region) на Y-хромосоме. Этот участок содержит ген, кодирующий материал, отвечающий за развитие мужского организма. Изучение этого участка является перспективным для анализа тех новообразований полового тяжа, в которых степень и направленность дифференцировки опухолевых клеток на уровне световой микроскопии не ясна. Пробы на половые хромосомы можно использовать и для точной характеристики клона трансплантированных клеток костного мозга (при разнополом доноре и реципиенте).
В заключение следует отметить, что морфологическая диагностика опухолей — чрезвычайно сложный и ответственный процесс, успешная реализация которого возможна не только с применением широкого спектра классических и современных методик, но и тесным поэтапным контактом патологоанатома и клинициста, при котором происходит как взаимное обогащение необходимой информацией, так и контроль оценки получаемых результатов.